绞股蓝总皂苷抑制NLRP3炎症小体活化改善高糖诱导的心肌损伤

摘要

背景：糖尿病是一类严重威胁全球人类生命健康的代谢性疾病，高血糖为其主要特征。中晚期糖尿病患者往往伴随有多器官受损的并发症，如心脏、肾脏、脑和血管等，这是导致患者生活质量下降甚至死亡的主要原因，其中对心脏的损害尤为严重。作为糖尿病心血管疾病常见的并发症之一，糖尿病心肌病已成为心力衰竭和死亡的主要原因。先前研究显示：血管内皮细胞或心肌细胞的功能障碍在糖尿病心肌病的发生发展过程中发挥着重要作用。除此之外，高血糖导致氧化应激和其他细胞信号的异常变化、肾素-血管紧张素系统活化及游离的脂肪酸增多等多种机制也参与糖尿病心肌损伤的发生发展。近年来，越来越多的国内外研究揭示炎症反应在糖尿病诱发的心肌损伤中也发挥着重要作用，长期炎症环境下可导致细胞及组织损伤，诱导其死亡。NLRP3炎症小体作为炎症活化的一种重要形式，在组织损伤中起着关键的作用，因此抑制 NLRP3炎症小体的活化可能是改善高糖诱导心肌损伤的有效策略之一。绞股蓝总皂苷作为一种传统中药的主要组分，具有抗炎和改善心血管疾病的功效，但其作用机制并不明确。在本研究中，我们拟用绞股蓝总皂苷，以探究其是否可通过抑制 NLRP3炎症小体的活化改善高糖诱导的心肌损伤。
　　目的：通过建立体内外高糖诱导心肌损伤模型，研究 NLRP3炎症小体是否参与高糖诱导的心肌损伤及其作用机制，并探讨绞股蓝总皂苷在改善高糖诱导心肌损伤过程中的作用及机制。
　　方法：体外研究中：利用不同浓度葡萄糖分别处理大鼠心肌细胞系（H9C2）6 h、12 h、24 h、36 h和48 h，分为正常对照组（5.5 mM），中等糖浓度组（25 mM）及高糖组（35 mM）。乳酸脱氢酶法分析心肌细胞损伤情况；四甲基偶氮唑盐法分析细胞活力情况；利用原位末端标记法及流式细胞术检测细胞的凋亡情况；通过实时定量荧光聚合酶链式反应检测炎症小体相关分子ASC、caspase-1和IL-1β的基因水平；利用蛋白印迹法及免疫荧光检测炎症小体相关分子的蛋白水平；应用 caspase-1抑制剂（Z-YVAD-FMK）后，乳酸脱氢酶法分析细胞损伤情况，同时蛋白印迹法检测炎症相关分子的蛋白水平；通过线粒体分离检测细胞色素c的释放，并应用细胞色素c及ROS抑制剂（Cyclosporin A及 NAC）后，乳酸脱氢酶法分析细胞损伤情况，蛋白印迹法检测炎症相关分子的蛋白水平；应用绞股蓝总皂苷后，通过流式细胞术、乳酸脱氢酶法及四甲基偶氮唑盐法检测细胞的凋亡、损伤及活力；同时蛋白印迹法检测细胞色素c的释放以及炎症小体的活化情况；体内建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，模型建立成功后，给予Z-YVAD-FMK（240 ng/只/次，共6次，尾静脉注射）及绞股蓝总皂苷（400 mg/kg/次，共14次，灌胃）治疗；实验结束后，处死大鼠，取心肌组织并提取总 RNA，实时定量荧光聚合酶链式反应检测炎症相关分子的基因水平；同时提取心脏组织总蛋白，通过蛋白印迹法检测炎症相关分子的蛋白水平；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠外周血中白细胞介素1β（IL-1β）含量；获取大鼠心肌组织并固定，制作石蜡切片进行苏木素&伊红染色，检测心肌组织的的病理学变化，免疫组化检测心肌组织中炎症小体的表达及分布情况。
　　结果：成功建立高糖诱导心肌细胞损伤模型及Ⅱ型糖尿病大鼠模型。乳酸脱氢酶法及四甲基偶氮唑盐法检测结果显示：与正常对照组（5.5 mM）相比，短时间内（6 h和12 h），中等糖浓度（25 mM）及高糖（35 mM）并不能显著诱导细胞受损，可随着时间的推移，细胞损伤情况加重，活力逐渐降低，并有浓度和时间依赖性；原位末端标记法及流式细胞术显示高糖可显著诱导心肌细胞凋亡；实时定量荧光聚合酶链式反应显示高糖显著上调炎症小体相关因子的基因水平，同时蛋白印迹法及免疫荧光证明高糖上调炎症小体相关因子的蛋白表达量；应用Z-YVAD-FMK后，下调了炎症小体相关蛋白的表达量，进而改善细胞损伤；线粒体分离结果显示高糖诱导细胞色素c从线粒体释放到胞浆中，在48h最明显，Cyclosporin A可减少细胞色素c的释放，抑制炎症小体的活化以及改善细胞损伤；同时，ROS抑制剂NAC显著降低线粒体中细胞色素c的释放以及炎症小体相关蛋白的表达，改善细胞损伤；应用绞股蓝总皂苷后，抑制了细胞色素c从线粒体释放到胞浆中，同时 NLRP3及相关蛋白表达均降低，进而改善细胞损伤；在糖尿病大鼠心肌组织中， NLRP3、ASC、caspase-1及 IL-1β的基因及蛋白水平显著上升；给予Z-YVAD-FMK及绞股蓝总皂苷治疗后，相关基因及蛋白表达降低。ELISA显示糖尿病大鼠外周血血清中IL-1β的含量明显高于正常大鼠，应用Z-YVAD-FMK及绞股蓝总皂苷后 IL-1β后的含量显著降低，具有统计学差异。HE染色显示与正常大鼠相比，糖尿病大鼠的心肌组织损伤严重，给予Z-YVAD-FMK及绞股蓝总皂苷后，损伤程度明显减轻；免疫组化结果显示糖尿病大鼠的心肌组织中有明显的炎症蛋白阳性颗粒，而给予Z-YVAD-FMK及绞股蓝总皂苷治疗后炎症蛋白明显减少。
　　结论：上述体外及体内实验均证明，高糖激活NLRP3炎症小体诱导心肌损伤，其作用机制是高糖导致线粒体受损，释放ROS，进而促使细胞色素c释放入胞质，激活NLRP3炎症小体，活化的NLRP3炎症小体促进IL-1β的成熟释放，进而介导心肌损伤。同时，传统中药绞股蓝总皂苷通过抑制细胞色素c的释放，调节NLRP3炎症小体活化，改善高糖诱导的心肌损伤，为临床运用提供了理论支持。

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缩略词表

前言

材料

1．细胞和实验动物

2．主要试剂、材料及试剂盒

3．实验仪器和设备

方法

1．动物模型建立

2．细胞培养

3．心肌细胞损伤检测

4. 统计学分析

结果

1. 高糖诱导大鼠心肌细胞系H9C2损伤

2. 高糖诱导心肌细胞NLRP3炎症小体的活化

3. 高糖诱导新生大鼠原代心肌细胞（NRVMs）损伤及活化NLRP3炎症小体

4. 高糖通过损伤线粒体，释放细胞色素c，活化NLRP3炎症小体

5. 高糖损伤线粒体释放的细胞色素c受ROS调控

6. 绞股蓝总皂苷（GYP）改善高糖诱导的心肌损伤

7. 绞股蓝总皂苷对高糖高脂诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型的治疗研究

讨论

结论

参考文献

综述炎症小体的研究进展

致谢

在读研究生期间的科研成果及获奖情况