拟南芥下胚轴向光弯曲反应相关蛋白P2SA1抑制子的筛选与鉴定

摘要

目前已报道有两类受体蛋白参与蓝光诱导的植物向光反应：一类是含 FAD的黄素蛋白-隐花色素（cryptochrome），具有蛋白激酶活性；另一类是参与植物向光性反应和叶绿体运动的向光素（phototropin），其发色团为黄素单核苷酸（FMN），具蓝光诱导的蛋白激酶活性。拟南芥中存在两个向光素蛋白 PHOT1和 PHOT2，在研究 PHOT1和PHOT2介导的向光弯曲调节机制过程中，已有多个向光素下游的信号分子如：NPH3（nonphototropic hypocotyl3）、RPT2（Root phototropism2）和PKS（Phytochrome kinase substrate）等被鉴定。向光素PHOT1和PHOT2感知蓝光信号后，能通过二者相互作用或者磷酸化途径传递信号，诱导生长素在下胚轴中的不对称分布，引起胚轴的不对称生长，植物表现弯曲生长。
　　PHOT1和 PHOT2在感受蓝光调节下胚轴向光弯曲过程中存在差异，PHOT1可介导较宽范围的蓝光反应，而PHOT2仅介导强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲反应，并与PHOT1表现功能冗余。这种功能冗余性，不利于PHOT2介导弯曲反应的机制研究。为此，课题组前期以拟南芥 phot1突变体为材料进行 EMS诱变，筛选强蓝光不敏感突变体，获得一株稳定遗传的缺失强蓝光诱导的向光弯曲突变体，图位克隆显示该突变体表型是由于P2SA1(Phototropin Signaling Associated1)基因突变所致。前期功能分析虽已证实 P2SA1作为向光素下游信号分子，仅调节强蓝光诱导的植物向光性反应，然而其具体调节机制并不清楚。
　　为从一个侧面研究 P2SA1介导强蓝光诱导下胚轴向光弯曲的机制，我们以 P2SA1基因对应的T-DNA插入突变体p2sa1为材料进行EMS诱变，筛选向光弯曲恢复突变，寻找P2SA1基因可能的抑制子。T-DNA插入的Atp2sa1纯合突变体，经过EMS化学诱变剂处理的种子为M1代材料，将M1繁殖一代得到M2代材料，即为筛选Atp2sa1突变体抑制子的诱变库。通过对诱变库植株进行初步筛选，共获得八株有表型的候选抑制子突变体，这些突变体黄化苗在P2SA1基因功能缺失的情况下仍能响应单侧强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应。对这8株候选抑制子突变体进行遗传学分析，共获得两个能够稳定遗传的株系 M65和 M120。分别将其与 Atp2sa1突变体进行回交，通过对回交 F2代材料发生下胚轴向光弯曲反应的性状分离比统计分析发现，下胚轴发生弯曲的株数与不发生弯曲的株数比值接近1：3，表明M120黄化苗在单侧强蓝光诱导时表现出下胚轴向光弯曲运动的性状在P2SA1基因纯合突变的前提下由另一个单基因隐性突变所致。
　　表型分析结果显示，单侧强蓝光处理，能够诱导M120黄化苗下胚轴的向光弯曲，出现WT表型。然而强蓝光处理，叶绿体避光运动正常，表型类似于WT和Atp2sa1突变体，M120和P2SA1均不参与强蓝光下向光素介导的叶绿体避光运动反应。下胚轴生长抑制实验，证实M120同样不参与下胚轴生长抑制调节。上述表型综合分析，初步证实M120可能特异调节P2SA1介导下胚轴向光弯曲反应。
　　为进一步研究M120对P2SA1功能调控，我们对M120突变体进行图位克隆。首先将M120与Ler杂交获得杂交F1代材料，繁殖一代后得到下胚轴向光弯曲性状发生分离比的F2代群体。从F2代挑取下胚轴向光弯曲的植株进行P2SA1基因T-DNA插入的纯合体鉴定，鉴定出的纯合体即为图位克隆遗传作图时定位所用样本（下胚轴向光弯曲且P2SA1基因为纯合突变的植株约占F2代的1/16，本实验共鉴定出538个样本）。通过对构建的遗传作图群体进行定位实验，将突变基因初步定位在2号染色体中上端。结合M120图位克隆精细定位的初步结果以及M120全基因组高通量测序结果，初步挑选出7个疑似抑制子候选基因，对其进行了基因测序验证，并订购了相关的T-DNA插入突变体，以待后期对基因进行功能回补验证。

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主要英文缩写表

前言

1.1植物的向光性运动研究进展

1.2蓝光诱导植物向光弯曲运动反应机制中的信号分子

1.3向光素在不同光强下诱导植物向光反应的差异

1.4遗传学方法在分离信号分子中的应用

1.5研究目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验仪器与试剂

2.3引物序列的合成

2.4实验方法

3结果与分析

3.1抑制子的筛选

3.2 M120的遗传学分析

3.3 M120的生理表型分析

3.4 M120突变体中P2SA1抑制子基因的图位克隆

4讨论

4.1 Atp2sa1突变体疑似抑制子出现T-DNA丢失的现象

4.2 M120生理变化与其对Atp2sa1突变表型抑制作用的关系

4.3 遗传作图群体的构建对M120图位克隆结果的影响

5结论

参考文献

致谢