H2S通过ROS/MAPK和NF-κB信号通路抑制凋亡和炎症改善慢性肾衰

摘要

背景：
　　慢性肾衰竭是一个严重的全球性公共卫生问题，尤其在中老年人群中具有很高的发病风险，并且除了定期的透析，没有更好的治疗方法。慢性肾衰是机体很多种肾脏疾病的终末阶段，其病理生理机制就是肾脏内活性氧簇生成增多，细胞凋亡且伴随有炎症反应，坏死细胞增多，最终导致肾小球的硬化和肾小管间质的纤维化。因此，寻找一种旨在缓解慢性肾功能衰竭的治疗方法就显得尤为重要。
　　硫化氢（Hydrogen sulfide，H2S）已经成为一种公认的气体信号分子，越来越多的证据证明硫化氢在哺乳动物体内起着很重要的作用，广泛参与着生理与病理生理学功能。也有许多研究表明，H2S可以调节肾功能，还可以通过调节血管的舒张和参与肾小管离子的转运来增加尿钠的排泄。在肾缺血再灌注模型，糖尿病肾病等模型中，硫化氢都参与其中并且缓解了这些疾病。然而，硫化氢是否能够缓解慢性肾功能衰竭尚不明确。
　　目的：
　　探讨硫化氢对慢性肾衰是否具有改善作用，并研究其作用机制。
　　方法：
　　1.体外实验
　　我们用庆大霉素（gentamicin，GEN）来诱导正常大鼠肾脏细胞（NRK-52E-cell）损伤模型，给予具有肾毒性的庆大霉素3mmol/L加入培养基中培养24小时即可以诱导出肾细胞损伤模型。体外实验分3组：对照组（control组），GEN组（模型组），GEN+H2S组（硫化氢处理组）。细胞通过庆大霉素处理，把细胞模型建好以后，GEN+H2S组给予含有100μmol/L的硫化氢的供体（硫氢化钠）培养基共培养，而对照组和GEN组用等体积的PBS加入培养基中培养，24小时后检测相关指标。
　　1.1.细胞增殖与活力实验
　　EdU增殖实验和MTS活力测定
　　EdU是一种核苷类似物，它的分子结构与胸腺嘧啶极为相似，它通过与Apollo567荧光染料发生特异性反应，与细胞的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleotide，DNA）结合，用来测定细胞分化与增殖的能力。细胞增殖率=（EdU阳性细胞）/（总细胞数）×100%。用MTS给NRK-52E-cells染色后在酶标仪上检测其吸光密度值（Optical density value，OD值），来检测活细胞数目，OD值越大，NRK-52E-cell的活力就越强。
　　1.2.细胞内活性氧（ROS）的检测
　　ROS水平的检测是运用可以发荧光的细胞探针DCFH-DA装载细胞后与胞质内一些物质发生反应,在显微镜下计算细胞发出荧光数量的多少，荧光越多说明ROS生成就多。在37℃细胞培养箱内，贴壁细胞用10μmol的DCFH探针孵育细胞达30分钟然后再用无血清的细胞培养基洗涤三次。然后用荧光显微镜观察并统计。
　　1.3.细胞凋亡检测
　　用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测，当细胞发生凋亡的时候，细胞核里面的DNA就出现了断裂，这时候3，-OH就被暴露在外面，通过试剂盒里面的试剂末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），在其催化下加上红色荧光Cy3标记的dUTP，从而通过荧光显微镜可以检测细胞凋亡的数量。然后再用DAPI染所有的固定细胞。凋亡指数=（阳性凋亡细胞）/（细胞总数）×100%。
　　2.体内实验
　　2.1.大鼠实验模型的建立与分组
　　动物实验分3组：对照组（control组），模型组（CRF组），硫化氢处理组（CRF+H2S组）。建模：模型组和硫化氢处理组用0.75%的腺嘌呤给大鼠灌胃，连续4周，即可建成慢性肾衰模型。对照组的大鼠同模型组一样也是定时定人用等体积的灭菌用水灌胃。处理：对照组和模型组每天给予生理盐水腹腔注射，而硫化氢处理组则给予硫氢化钠100μM/kg/day腹腔注射，连续4周。在硫化氢处理期间，大鼠每周称重，并记录24小时的食物摄入量，水的摄入量和排尿量。在动物实验完成后，麻醉状态下，从大鼠心脏采血，用灭菌过的PBS充分灌洗肾脏，直至颜色变为苍白，取出肾组织，最后处死大鼠。
　　2.2.病理组织学分析
　　肾组织用4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5μm厚的病理切片进行苏木精-伊红染色（HE）和马松染色（Masson，MT）。
　　2.3.血常规与生化指标的检测
　　动物麻醉后迅速取血，取全血检测血白细胞（WBC）水平、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞压积（HCT），全血离心后检测血浆内尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）的水平。把大鼠放入代谢笼中24小时，收集尿液用来化验尿蛋白/24h的含量。把肾切成小块进行匀浆，ELISA技术测定肾脏组织炎性细胞因子的表达水平如单核细胞趋化蛋白（MCP-1），肿瘤坏死因子（TNF-α）白介素家族（比如IL-6和IL-10）的表达水平。
　　2.4.Western-Blot检测
　　用Western-Blot方法检测：与MAPK信号通路相关蛋白的表达：细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)，phospho(p)-ERK1/2(Thr202/Tyr204)，c-Jun末端激酶(JNK)，p-JNK(Thr183/Tyr185)，p38，p-p38(Thr180/Tyr182)；与NF-κB通路相关蛋白的表达p50，p65和p-p65(Ser536)；与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved caspase-3的表达。
　　2.5.氧化应激和抗氧化相关指标的测定
　　肾脏内氧化应激产物：丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的含量。抗氧化的两个关键酶：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性测定。
　　结果：
　　1、H2S可以降低庆大霉素诱导的NRK-52E细胞中的活性氧（ROS）水平，可以减轻细胞的凋亡，并且与GEN组比较，GEN+H2S组的细胞增殖能力和细胞活力都有所提升（P<0.01）。
　　2、组织学上，病理切片HE染色示：对照组组肾结构完整，CRF组可见大量肾小管上皮细胞坏死，部分管腔扩张明显，肾小球萎缩或硬化，肾脏结构损害比较严重。H2S+CRF组可见少量的肾小管管腔扩张，间质部位仅有轻度水肿，肾小球和肾小管上皮细胞坏死程度较轻。Masson染色示：对照组间质不存在纤维化，CRF组可见肾小管之间间隙增宽，间质内存在大量蓝染的胶原纤维，H2S+CRF组间质有部分纤维化。
　　3、与凋亡相关的蛋白Western-Blot结果显示：与CRF组比较，H2S+CRF组的Bcl-2的表达增加，Bax，Caspase-3及Cleaved-caspase-3表达减少。
　　4、在氧化和抗氧化水平上，与CRF组比较，给予硫化氢处理过的大鼠肾脏中的MDA和ROS的含量明显降低（P<0.01）而SOD和GSH-Px这两个酶的活性明显提高（P<0.05）。
　　5、MAPK相关蛋白的表达：CRF组的phospho(p)-ERK1/2(Thr202/Tyr204)，p-JNK(Thr183/Tyr185)，p-p38(Thr180/Tyr182)蛋白表达明显升高，而给予硫化氢处理后上述磷酸化的ERK，JNK，p38表达明显降低（P<0.05）。
　　6、NF-κB相关蛋白的表达：p50、p65、phosphoated-p65(Ser536)蛋白表达在CRF组的明显升高，而在H2S+CRF组明显降低（P<0.05）。
　　7、肾组织内细胞炎症因子的表达：模型组的单核细胞趋化蛋白（MCP-1），肿瘤坏死因子（TNF-α）白细胞介素6（（IL-6），白细胞介素10（IL-10）是明显高于对照组的，而给予硫化氢处理后这些炎症水平较模型组明显减低（P<0.01）。
　　结论：
　　1、硫化氢可以明显改善慢肾功能衰竭；
　　2、H2S通过ROS/MAPK信号通路抑制了肾细胞的凋亡；
　　3、H2S通过NF-κB信号通路，抑制了肾组织炎症反应；
　　4、硫化氢及其衍生物对于慢性肾衰具有很大的治疗潜力。

目录

英文缩略词表（ABBREVIATION）

前言

1 材料与方法

1.1 实验模型的制作

1.2 主要的实验仪器、试剂及配制方法

2 主要的实验方法及步骤

2.1 细胞实验的方法和步骤

2.2 动物实验的方法和步骤

2.3统计学分析处理数据

3 结果

3.1硫化氢对庆大霉素损伤的NRK-52E细胞的活力和增殖能力的影响

3.2硫化氢对庆大霉素损伤的NRK-52E细胞ROS的产生和凋亡的影响

3.3硫化氢对CRF大鼠各种生理指标的影响

3.4 硫化氢对CRF大鼠肾功能和血常规指标的影响

3.5 硫化氢对CRF大鼠肾脏组织病理学的影响

3.6 硫化氢对CRF大鼠肾脏凋亡的影响

3.7硫化氢对CRF大鼠肾脏氧化和抗氧化相关指标的影响

3.8 硫化氢在MAPK信号通路中的调节作用

3.9硫化氢对CRF大鼠炎症因子表达的影响

3.10硫化氢对CRF大鼠NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

4 讨论

结论

参考文献

综述:硫化氢在肾脏中的生理功能及其在肾脏疾病中的作用

在读期间的科研成果和参加的学术会议

致谢