分泌型蛋白PTEN-Long对神经胶质瘤细胞系U87MG增殖和迁移的影响

摘要

背景:
　　pten（Phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome10）人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，位于10q23.3，转录产物为515 kb mRNA，属于PTP（protein tyrosine phosphatases）基因家族成员。自1997年PTEN蛋白作为抑癌因子被发现以来，受到世界各地研究者的广泛关注，在目前已有的研究中，PTEN作为一个双重特性的磷酸酶，同时具有脂质和蛋白磷酸酶特性。它的脂质磷酸酶活性能够将PI3K信号通路中的PIP3水解成为PIP2，从而阻断该信号通路，降低下游AKT的活化，减少了细胞的恶性增生。另外，PTEN还具有蛋白磷酸酶活性，它主要作用于底物蛋白的丝、苏氨酸及酪氨酸位点。在大多数癌细胞中，许多关键基因产物磷酸化水平都是不正常的，PTEN能够去磷酸化这些蛋白而显示抑癌作用。目前，PTEN作为研究比较火热的一个抑癌基因，许多生物学功能还不是了解的特别清楚，例如：PTEN除了起磷酸酶作用外，一部分研究表明，PTEN在细胞核内似乎有维持染色体稳定的功能。
　　另外，PTEN-Long作为PTEN的一个翻译变异体，选择PTEN起始翻译位点前519位的CTG作为起始位点开始翻译，形成了比经典PTEN多173个氨基酸的蛋白，该蛋白可被细胞分泌出细胞膜，穿梭进入并作用于临近细胞。这使得它不同于经典PTEN，吸引了许多临床研究工作者的兴趣。PTEN-Long同经典PTEN一样具有脂质磷酸酶活性，能够抑制PI3K信号通路，经过分泌和穿梭后，实现远距离调控临近细胞的生长、凋亡等活动。在已有的研究中，PTEN的缺失与异常往往与肿瘤的发生发展有密切的关系，许多文献和报道表明PTEN在多种散发性癌症和两种常染色体显性遗传的错构瘤综合征中突变。传统意义上的治疗致力于完全恢复PTEN基因的表达，但这通常很难实现的。现在我们可以利用PTEN-Long出入细胞膜的功能，同时采用一些靶向治疗手段，将PTEN-Long精准定位并有效作用于癌细胞，这将是未来临床治疗的一个方向。
　　目的:
　　本课题通过研究分泌型蛋白PTEN-Long表达载体的构建和大量表达的方法，系统验证了PTEN-Long对癌细胞的抑制作用，这对于我们深入认识PTEN及PTEN-Long表达的调控新机制有益，而且该研究在肿瘤临床治疗方面具有潜在的应用市场。
　　方法:
　　构建表达PTEN-Long的载体，大量表达并纯化该蛋白。同时，包装PTEN过表达以及空载体对照慢病毒。利用包装好的PTEN过表达和空载体对照慢病毒常规方法感染U87细胞，形成PTEN稳定过表达以及对照的U87细胞系，并用Western blot验证阳性细胞株。利用获得的PTEN过表达U87稳定细胞株作为阳性对照，在PTEN缺陷表达的野生型U87中直接加入纯化好的PTEN-Long蛋白，验证其细胞生物学功能。
　　结果:
　　1.成功构建PTEN-Long原核载体，蛋白诱导表达目前正在优化表达条件。
　　2.成功构建PTEN-Long真核表达载体并成功表达及纯化。
　　3.在PTEN天然缺失的U87细胞中，加入PTEN-Long处理之后，同经典PTEN作用相似，观察到PTEN-Long对于细胞增殖生长以及迁移侵袭都有抑制作用。
　　结论:
　　1.成功构建PTEN-Long载体，与6×His融合蛋白能够成功表达并进行蛋白纯化。
　　2.PTEN-Long同PTEN作用相同，能够抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵袭。

目录

英文缩略词表

前言

1.实验材料

1.1 主要材料试剂

1.2 试剂配制

1.3 仪器设备

2.实验方法

2.1 细胞培养实验

2.2 Top10/BL21(DE3)等感受态细胞的制备

2.3 PTEN-Long表达质粒的构建

2.4 PTEN-Long蛋白的表达及分离纯化

2.5Western-blot实验验证

3实验结果

3.1原核诱导表达结果

3.2真核载体及蛋白表达结果

3.3 PTEN-Long蛋白的分离纯化

3.4 PTEN-Long蛋白的功能试验

讨论

结论

参考文献

综述:PTEN的外泌型PTEN-Long

致谢

攻读硕士期间发表的论文