载有毒中药CTD肿瘤靶向聚合物胶束研究

摘要

以毒攻毒是中医治疗恶性肿瘤的重要手段之一。中医长期临床实践证明大毒中药斑蝥具有显著的抗肿瘤效果。毒性成分斑蝥素(CTD)是斑蝥抗肿瘤的有效成分，是蛋白磷酸酶PP1和PP2A的选择性抑制剂，但其安全使用范围窄，对胃肠道、泌尿系统及肾脏功能均有一定的损伤，限制了其在临床上的广泛应用。聚合物胶束能将难溶性药物包载于其疏水性内核中，提高药物在肿瘤组织的富集，延长体内循环时间。因此构建载CTD聚合物胶束纳米给药系统，提高CTD的肿瘤靶向性，降低其毒副作用具有十分重要的意义。
　　载CTD聚合物胶束纳米给药系统的构建。采用基团贡献法计算CTD、PLA、PLGA、PCL的部分溶解度参数并进行比较，确定聚合物材料疏水端类型；以载药量、包封率、粒径、CMC为评价指标，确定载体材料的分子量；以载药量、包封率和粒径等为评价指标，通过单因素考察确定胶束的制备方法，HPLC法测定胶束中CTD的含量。结果表明，CTD与PLGA相容性最好，通过对比，选用mPEG2000-PLGA2000作为载体材料，薄膜分散法制备CTD胶束，包封率和载药量分别为(89.88±1.01)％、(4.30±0.05)%，粒径为(25.32±1.25)nm，PDI为(0.08±0.02)。
　　载CTD聚合物胶束纳米给药系统的质量评价。透射电镜观察胶束的形貌，呈大小均一的球状结构。采用DSC和XRD法考察药物在聚合物胶束中的存在形式，结果表明，CTD以无定形状态存在于胶束中。考察载药胶束的稳定性，-4℃放置20天，粒径均匀，HPLC法测定药物含量，无药物泄露现象；加入0.9%NaCl、200U/mL肝素、0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，37℃、120r/min摇床孵育24 h，胶束粒径无明显变化。考察载药胶束在血浆中的稳定性，HPLC法进行分析。结果表明，与原药相比，胶束可以明显提高CTD在血浆中的稳定性。体外溶血试验表明，空白胶束和载药胶束均不会造成溶血现象。采用透析法考察胶束的体外释放性能，结果表明，CTD胶束具有明显的突释现象，其释放曲线符合一级释药方程。
　　载CTD聚合物胶束纳米给药系统体内外抗肿瘤作用研究。采用MTT法测定空白胶束、CTD原药和CTD胶束对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用。结果表明：空白胶束作用于各细胞24h、48h后均无明显的抑制作用；作用48h，CTD原药对HepG2、MCF-7的IC50值分别为(2.57±0.25)μg/mL、(2.50±0.18)μg/mL，CTD胶束对HepG2、MCF-7的IC50值分别为(1.75±0.20)μg/mL、(2.10±0.13)μg/mL，胶束可以明显提高CTD对HepG2、MCF-7细胞的抑制作用。采用Hoechst33342单染法、AO/EB双染法检测 HepG2肿瘤细胞凋亡情况。结果表明，相同药物浓度的CTD原药和CTD胶束作用于肿瘤细胞，CTD胶束更易引起肿瘤细胞的凋亡。建立昆明小鼠肝癌 H22皮下移植性肿瘤模型，考察CTD胶束的体内抗肿瘤作用。将荷瘤小鼠随机分为4组：模型组(生理盐水组，0.1mL/10g)、胶束组(400μg/kg)、原药组(400μg/kg)、环磷酰胺组(20mg/kg)。隔天给药，采用尾静脉注射方式。计算肿瘤体积、抑瘤率，HE染色法观察肿瘤组织的病理学变化。结果显示，胶束、原药对小鼠肝癌H22的抑制率分别为44.40%、28.05%，肿瘤病理切片显示，与原药组相比，胶束组肿瘤坏死区域明显增大。
　　载CTD聚合物胶束纳米给药系统减毒作用研究。采用MTT法测定空白胶束、CTD原药和CTD胶束对人正常肝细胞L-02的增殖抑制作用。结果显示空白胶束对L-02无抑制作用，作用24h，CTD原药和CTD胶束的IC50值分别为(2.12±0.22)μg/mL、(2.64±0.15)μg/mL，表明胶束可以明显减少CTD对正常细胞的毒性。通过计算小鼠脏器系数，HE染色法观察肾脏组织的病理学变化，测定小鼠血清生化指标，比较CTD胶束和CTD原药对小鼠毒副作用。结果显示原药组与模型组相比，脾脏系数明显降低，胶束组与模型组相比，无显著性差异；原药组33.3%小鼠肾脏系数超出正常范围，而胶束组均处于正常范围之内；肾脏病理切片显示，与模型组相比，原药组既出现血管球变小，囊腔变大的现象，又出现肾小球体积增大，肾小管边缘模糊水肿现象，而胶束组与模型组相比，无明显差异；CTD胶束可显著降低荷瘤小鼠血清中的UA含量使之趋于正常水平。
　　肿瘤细胞对聚合物胶束纳米给药系统摄取性能研究。以香豆素-6为模型药物，制备载香豆素-6的mPEG2000-PLGA2000聚合物胶束，荧光显微镜观察HepG2细胞对香豆素-6原药以及香豆素-6胶束的摄取状况，采用荧光分光光度计和高内涵细胞成像系统对香豆素6的摄取进行定量分析。结果表明mPEG2000-PLGA2000制备的载药胶束可以明显提高细胞对药物的摄取能力。
　　综上所述，本论文构建了载CTD聚合物胶束纳米给药系统，体外和体内实验表明，胶束可以明显提高肿瘤细胞对CTD的摄取能力，提高CTD的抗肿瘤作用，减少CTD 的毒副作用。

目录

声明

中英文缩略表

第一章 前言

1 CTD研究现状

2聚合物胶束研究现状

3本课题研究思路

第二章 mPEG-PLGA-CTD胶束的制备

1 材料和仪器

2 实验方法

3实验结果

4. 讨论

第三章mPEG-PLGA-CTD胶束的质量评价

1材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 mPEG-PLGA-CTD胶束体外抗肿瘤作用研究

1材料和仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

第五章 mPEG-PLGA-CTD胶束体内抗肿瘤作用研究

1实验材料

2实验方法

3 实验结果

4. 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的科研情况