口腔癌患者外周血树突状细胞的体外培养及表型分析

摘要

目的：口腔颌面部肿瘤是头颈部肿瘤的重要组成部分。在我国80％以上的口腔颌面部恶性肿瘤是鳞状细胞癌(简称鳞癌)，目前对口腔癌的治疗手段是以手术为主的综合治疗，由于颌面部能提供的切除面积有限，有时很难实现距肿瘤边缘1.5cm清除病灶，而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康。因此，如何能缩小手术范围、有效控制临床亚病灶及微小病灶的发展亟待解决。近年来，随着树突状细胞(dendriticcell，DC)体外诱导扩增技术的发展，DC用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究日趋增多，DC有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效手段。抗原递呈细胞(antigenpresentingcells，APC)与肿瘤细胞融合得到细胞融合疫苗以及基于树突状细胞的疫苗方案由于其明确的治疗效果而受到广泛重视。已有研究成果确立了体外诱导DC成熟在肿瘤免疫治疗中的地位。DC是机体内最重要的，功能最强的专职性抗原递呈细胞，也是机体免疫应答的有力启动者。近年来，随着DC的功能和生物学特性被不断认识，DC在肿瘤免疫、移植免疫和抗感染免疫等方面日益受到人们的重视，被运用于B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、转移性肾癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的临床尝试性治疗，并取得了令人鼓舞的疗效。DC激发T细胞增殖及抗原递呈能力是巨噬细胞和B细胞的100～1000倍。但它是一微量细胞群，在血液中仅占单核细胞总数的0.5％～1％，且缺乏特异性的标记物，其分离纯化极其困难，体外不易长期培养，更难建库，所以给研究及临床治疗带来了很大的困难。本试验通过对口腔鳞癌患者外周血单核细胞来源的树突状细胞进行体外培养，并对细胞形态、表型和功能，与正常人进行比较并分析其临床意义为口腔癌的生物治疗奠定基础。 方法：研究对象为15例(均取自河北医科大学第四医院口腔科2004年9月至2005年10月住院的口腔鳞癌初诊患者)，均未行过任何抗肿瘤治疗，发病部位包括舌、颊、牙龈、等处，临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期，年龄在20～60岁范围内，性别比为1：1，均经术后病理证实。对照组选择15例健康志愿者，两组均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病。无菌采集上述实验组和对照组每人外周血(20ml)置入淋巴分离液中经离心分离外周血单个核细胞，吸取中间细胞层，用D-Hank's和RPMI1640培养液洗涤细胞3次，弃上清，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×107个/ml，然后接种于6孔板，每孔3ml。5％CO2，37℃条件下孵育2～3小时后，吸出培养上清，用预热的培养基清洗板1次，以去除非贴壁细胞(冻存)，获得贴壁的单核细胞，加含1000u/mlrhGM-CSF和500u/mlrhIL-4的RPMI1640完全培养基进行培养，中间适量换液并补充细胞因子。5％CO2，37℃孵育5天，每孔加入TNF-α200u/ml，7天后得到悬浮成熟DC。收集培养的第1、3、5、7天用倒置显微镜观察DC形态，在培养的第7天收集DC电镜观察超微结构。收集培养5天、7天和10天的DC细胞行流式细胞仪检测细胞表型CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA-DR的表达变化。并对试验结果进行统计学分析。 结果：贴壁细胞诱导培养24小时后可见贴壁单核细胞聚集成大小不等的细胞聚体，第3天可见细胞聚集成团，少量悬浮生长，部分细胞体积增大。第5天，悬浮细胞数量增多，细胞表面有细小突起形成。第7天悬浮细胞或细胞团颜色变深，有明显树突状突起。培养第7天扫描电镜观察，DC表面粗糙，胞体向周围伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起。实验组透射电镜观察，DC细胞表面伸出长短不一的突起，线粒体致密化，粗面内质网扩张成池状，溶酶体较少。培养7天后，实验组CD83、CD1a的表达率较对照组低，差异有统计学意义(均P＜0.001)，但CD86、CD80、HLA-DR表达率两组差异无统计学意义(均P＞0.05)。 结论：口腔癌患者外周血单核细胞来源的DC联合应用GM-CSF，IL-4及TNF-α诱导培养后，能获得大量较高纯度并保持活性功能的具有典型形态的成熟DC，从而为DC治疗口腔癌的研究及临床应用奠定基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述人树突状细胞体外培养的研究进展

致谢

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