姜黄素对涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83增殖和凋亡的影响

摘要

目的：涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)，是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，该肿瘤具有侵袭性强、浸润性生长、早期沿神经血管束向远处扩展和转移等特征。目前临床对于SACC的治疗仍以手术切除为主，但手术治疗难以彻底切除，术后复发率较高，远期疗效较差，对放疗不敏感，传统的化疗药物效果不显著，因此，探索新的治疗方法成为学者们关注的焦点，利用从植物中提取的有效成分抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡成为目前研究的热点之一。姜黄素(curcumin，CUR)是从姜黄根茎中提取、分离出的一种酚类色素成份，曾在印度被用于炎症的治疗。近年实验研究发现姜黄素具有抗肿瘤作用，机制还不完全清楚，可能与抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡有关。目前国内外，尚未见姜黄素作用于SACC的研究报道。本实验是探讨姜黄素抗SACC的作用，并探索其机制，为SACC的治疗提供新的思路和方法。 材料与方法：1.材料(1)细胞系：SACC-83，购自北京大学医学部口腔颌面外科实验室，由北京大学医学部口腔颌面外科于1983年建立。(2)姜黄素：对照品，中国药品生物制品检定所提供。2.方法：(1)培养器械的处理。(2)药液配制：姜黄素用无水乙醇溶解配制成20mg/ml储存液，使用前用培养液稀释。(3)细胞培养：采用RPMI1640培养基加入10％胎牛血清和青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)，于37℃、5％CO2恒温箱内饱和湿度培养，24～48小时传1代，以0.04％二乙胺四乙酸二钠(EDTA)和0.25％胰蛋白酶(1：1)混合液消化传代。(4)MTT比色试验：取对数生长期细胞制成2×107·L-1细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，培养24h后，加入姜黄素100μl，使终浓度为2.5、5、10、15、20mg/L，设对照组和调零孔，每组6个复孔。继续培养24、48、72h后，每孔加入20μl的5g/L的MTT溶液，再培养4h后小心吸去全部上清液，然后每孔加入200μl的二甲基亚砜(DMSO)，振荡摇匀，使结晶充分溶解。置酶标仪上测各孔吸光度值，并计算生长抑制率。(5)倒置相差显微镜观察：将细胞接种于50ml培养瓶中，观察细胞在空白培养基和含药培养基中不同培养时间的生长状况。(6)光镜观察：将细胞接种于6孔板中，孔中放置盖玻片，爬片成功后加入空白或含药培养基，培养不同时间后，Giemsa染色，光镜观察。(7)流式细胞术检测：用空白培养基和不同浓度的含药培养基处理细胞不同时间后，用Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞的方法检测细胞凋亡。(8)透射电镜观察：于4℃离心收集正常培养细胞和药物处理细胞5×106～1×107个，PBS液洗2次，固定、脱水、包埋、切片和染色均按常规处理，透射电镜观察。3.统计学分析：使用SPSS10.0统计学软件，应用SNK-q检验、相关分析、x2检验对细胞生长抑制率和凋亡率进行统计学分析。 结果：1.MTT比色试验：姜黄素(5mg/L以上)对SACC-83细胞具有明显的生长抑制作用，药物作用24h、48h、72h后的IC50分别为13.8mg/L、11.2mg/L、8.2mg/L；最大生长抑制率可达90.9％。经统计学分析，各时间组不同浓度之间吸光度值明显不同(P＜0.01)，10mg/L、15mg/L和20mg/L不同处理时间之间生长抑制率不同(P＜0.01)，药效与药物浓度和作用时间具有明显的正相关性。2.倒置显微镜观察：对照组细胞贴壁生长，扁平多角形，胞质饱满，近中央处有圆形的细胞核，呈“铺路石”状生长，生长迅速；用药组细胞生长明显减慢，可见有细胞脱落，贴壁细胞变圆，甚至皱缩变小，连接松解，核颜色加深，细胞折光性增强。3.光镜观察：对照组细胞核浆比大，多个核仁；用药组胞质浓缩，核浆比例降低，核仁减少或消失，出现染色质沿核膜内侧排列的核边集现象，可见核碎裂现象。4.流式细胞术检测：对照组细胞也有凋亡，但凋亡率很低；用药组细胞明显凋亡，凋亡率随处理时间延长和药物浓度增加而上升，药物浓度达到10mg/L时细胞凋亡明显增加，经统计学分析，各时间组和各浓度组之间有统计学差异(p＜0.01)。5.透射电镜观察：对照组细胞完整，核仁大而明显，微绒毛和内质网丰富，未找到凋亡细胞；用药组细胞膜表面微绒毛消失，体积变小，胞质浓缩，染色质凝集、固缩，聚集于核膜下呈境界分明的块状或新月体形，有的可见核碎裂及凋亡小体的形成。 结论：姜黄素具有抑制涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83增殖和诱导其凋亡的作用，且具有浓度和时间依赖性。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展

致谢

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