急性百草枯中毒大鼠肺组织p38MAPK、NF-κB、TGF-β、MMPs、TIMPs的变化及褪黑素的治疗作用研究

摘要

百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范围内广泛使用的除草剂。随着其在我国农业上的广泛应用，PQ中毒也日趋增多。PQ 经皮肤接触、呼吸道及消化道进入体内，造成急性中毒。PQ对人畜均有较强毒性，中毒致死剂量小，口服致死量为30-40mg/kg。PQ中毒病程进展快且目前尚无特效解毒药物，在临床上病死率很高，报道可高达80％以上。肺为PQ中毒的主要靶器官，也是百草枯中毒死亡的主要原因。大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡；较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化，病程相对较长，晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。 PQ的肺毒性早期表现为急性肺泡炎，以后表现为进行性加重的肺间质纤维化。PQ引起肺损伤及后期肺纤维化的病理生理机制还未阐明。由于在PQ中毒早期主要表现为急性肺泡炎性改变，因此有多种促炎细胞因子参与其中，p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinasesMAPK)作为MAPK家族的成员，其信号转导通路在炎性反应性疾病的发生和发展中具有重要调控作用，能被多种炎性刺激所激活，参与介导细胞应激反应、免疫反应和细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞问的功能同步等多种过程；而核因子kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)是普遍存在于真核细胞中的一个转录因子，在炎症反应的细胞因子网络调节中起关键作用，最新研究发现NF-kB可以氧自由基激活，这种活化效应可被抗氧化剂所抑制。近年来研究表明，肺间质纤维化是细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的过度沉积造成的，这种过度沉积不仅是由于ECM合成增多，更大程度上是ECM降解减少即合成和降解不平衡引起的。其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其组织抑制因子(tissueinhibitor of metal|oproteinnase，TIMPs)在ECM合成/降解的调节过程中起着非常重要的作用，而在某些MMPs基因的启动子区域存在有NF-kB的结合位点。TGF-β<,1>是参与肺纤维化的细胞因子中研究最深入、作用最重要的因子。它能促进成纤维细胞合成胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质，促进细胞外基质的沉积；它还能减少基质降解蛋白酶的产生，增加这些蛋白酶抑制物的水平，因此其在肺纤维化过程中起重要作用。褪黑素(melatonin，MT)是由松果体分泌的一种吲哚胺类激素，研究发现MT。具有高亲脂性，因此具有高度弥散穿透能力，能在细胞膜、胞浆和细胞核中发挥抗氧化作用。MT可有效清除化学反应中的氧自由基，亦可抑制过氧化氢引起的过氧化脂质含量的升高，还能增强体内抗氧化酶的活性，故能有效保护生物大分子如脂质、DNA免受自由基损伤，从而对氧自由基的损伤起保护作用。是目前已知的抗氧化作用最强的内源性自由基清除剂。推测MT 能减轻PQ所致组织过氧化损伤和肺纤维化形成。 p38MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs和 TIMPs 在PQ中毒所致肺损伤中的变化以及MT对它们的影响在国内外尚未见报道。本研究试图通过PQ灌胃染毒制成PQ中毒模型，并给予 MT 作为干预措施，观察其病情变化及不同时间体内肺组织病理改变，及肺组织中p38 MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs与TIMPs的表达变化，了解它们在PQ中毒肺损伤中的作用，进一步探讨PQ中毒肺损伤的发病机制及MT对PQ中毒的治疗作用。 本实验共包括三个部分。 第一部分急性百草枯中毒大鼠肺间质改变及其调控机制 目的：观察PQ中毒大鼠体内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力及肺组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的变化，探讨它们在PQ中毒所致肺组织损伤中的作用。 方法：选择健康成年SD大鼠48只，随机分为两组：对照组(A组)6只，染毒组(B组)42只。B组应用PQ50mg/kg灌胃制作染毒模型；A组生理盐水(NS)灌胃。分别于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后开胸，先心脏取血，测定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺组织，测定肺组织匀浆羟脯氨酸含量，采用 RT-PCR 法测定肺组织MMP-2、MMP-9及。TIMP-1 mRNA的表达；另取肺组织行HE染色、Masson染色、免疫组织化学染色及电镜观察。A组行同样处理。 结论：1.百草枯中毒引起的肺损伤主要表现为早期的急性肺泡炎和以后逐渐进展的肺间质纤维化。 2.百草枯中毒大鼠体内MDA含量升高、SOD及GSH-Px 活力下降，说明 PQ 可引起肺内炎性反应，进而产生的过氧化损伤及肺内氧化-抗氧化系统失衡是造成急性肺损伤的主要机制。 3.百草枯中毒致急性肺损伤后，肺内MMP-2、MMP-9及 TIMP-1 的表达不同步造成ECM合成和降解不平衡，从而诱导肺纤维化形成。 第二部分急性百草枯中毒大鼠肺组织中NF-kB、 TGF-β<,1>及p38MAPK的变化研究 目的：观察中毒大鼠肺组织中NF-kB活性、TGF-β<,1> 及磷酸化p38MAPK的变化，探讨其在急性百草枯中毒所致肺损伤中的作用。 方法：选择健康成年SD大鼠48只，随机分为两组：对照组(A组)6只，染毒组(B组)42只。B组于染毒后1d、3d、7d、14d、21d，28d、35d各取6只大鼠，留取肺组织。采用电泳迁移率改变分析法(EMSA)测定NF-kB 活性，Western blot法测定磷酸化p38MAPK蛋白表达，RT-PCR法测定MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 TGF-β<,1> mRNA 的表达；同时行免疫组织化学观察。A组行同样处理。 结论：本研究显示，中毒大鼠肺组织中NF-kB、p38MAPK及TGF-β<,1>表达均明显增强，与MMPs/TIMPs的异常表达及比例失衡密切相关。它们之间相互作用，互为因果，参与了肺组织的炎性损伤、组织结构破坏以及随后的组织修复过程，从而引起肺组织损伤和肺纤维化形成。其中NF-kB和p38MAPK在中毒早期表达增强，可能在肺泡炎阶段起重要作用；而TGF-β<,1>在中毒后期仍维持高水平，与TIMP的变化一致，可能在纤维化形成过程中发挥更为关键的作用。 第三部分褪黑素治疗急性百草枯中毒大鼠肺损伤的分子机制研究 目的：观察褪黑素(MT)对染毒大鼠体内MDA、 SOD、GSH-Px活力及肺组织MMPs、TIMPs、NF-kB、TGF-β<,1>及p38MAPK 表达的影响，探讨MT对急性百草枯中毒的治疗效果。 方法：选择健康成年SD大鼠90只，随机分为三组：①对照组(A组)6只；②染毒组(B组)42只；③MT治疗组(C组)42只：PQ灌胃染毒后，给予MT10mg/kg腹腔注射，每日一次；A组和B组每日给予等量NS腹腔注射。分别于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后开胸，先心脏取血，测定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺组织，测定肺组织匀浆羟脯氨酸含量；采用RT-PCR 法测定肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 TGF-β<,1> mRNA 的表达；电泳迁移率改变分析法(EMSA)测定NF-KB活性；采用Westem blot法测定磷酸化p38MAPK蛋白表达；另取肺组织行HE染色、Masson染色及免疫组织化学染色。A组行同样处理。 结论：应用MT治疗，可明显降低百草枯中毒大鼠血清MDA含量，增加SOD及GSH-Px活力；减轻染毒大鼠肺组织早期的炎性改变及后期的肺纤维化趋势，这可能与MT较强的抗氧化功能以及降低肺组织NF-kB活性，减少TGF-β<,1>、磷酸化p38MAPK的表达，调节MMPs和TIMPs之间的平衡有密切关系。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分急性百草枯中毒大鼠肺间质改变及其调控机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分急性百草枯中毒大鼠肺组织NF-κB、TGF-β1及p38MAPK的变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分褪黑素治疗急性百草枯中毒大鼠肺损伤的分子机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述：p38丝裂原活化蛋白激酶在呼吸道炎症反应中的作用

致谢

个人简历