金属硫蛋白-3在食管癌中的表达及其CpG岛超甲基化研究

摘要

目的：食管癌是人类常见的恶性肿瘤。中国男、女平均死亡率分别为7.7/10万和18.8/10万<'[1]>，严重危害着人们的健康。流行病学资料显示膳食缺乏维生素、亚硝酸盐含量增高以及食物霉菌污染等可能与食管癌发生有关<'[2，3，4]>。随着分子生物学的发展，发现食管癌的发生发展涉及到多个基因的改变，是癌基因的激活与抑癌基因失活长期协同作用的结果。因此深入研究食管癌的发病机制，以有效地对其进行预防和治疗有着非常重要的意义。如同其它恶性肿瘤，食管癌的发生和发展包括遗传机制和后生机制，而甲基化是目前已知的唯一后生机<'[5]>。金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛分布于生物体体内的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质，在维持金属离子内稳态、重金属的解毒、清除自由基等方面具有重要作用。至今已发现MT的四种同分异构体，即MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。相对于其他金属硫蛋白，MT-3具有特异结构和特异生物学功能，是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白质<'[6]>。有研究显示胃癌中MT-3基因存在异常甲基化<'[26]>。本课题应用MethvlatedSpecific PCR(MSP)法和Reverse Transcription PCR(RT-PCR)法检测食管癌细胞株、新鲜食管癌标本及其对应正常食管粘膜组织中MT-3基因CpG岛的甲基化情况及MT-3的表达情况，旨在研究MT-3基因CpG岛超甲基化与食管癌之间的关系。材料与 方法： 1 选取四种食管癌细胞株：OE33、Eca109、TEl和TEl3，根据结果选择一种食管癌细胞株作为阳性对照；采集胃癌手术中近侧端正常食管粘膜(均经术后病理证实、)5例做为阴性对照；采集手术切除的食管癌组织及对应的正常食管粘膜组织各20例。 2 分别提取上述细胞株和组织的DNA和RNA，DNA进行亚硫酸氢钠处理后，应用MSP法对MT-3基因启动子区CpG岛甲基化情况进行研究；应用RT-PCR法对MT-3 mRNA的表达进行研究，然后与患者临床病理参数进行比较。 结果： 1 四种食管癌细胞株MT-3基因CpG岛均存在超甲基化，细胞株0E33发生甲基化，细胞株Eca109、TEl和TEl3为半甲基化。反转录PCR显示：MT-3 mRNA在细胞株OE33中无表达，在细胞株Eca109、TEl和TEl3中均有弱表达。故选择细胞株OE33做为阳性对照。 2 65％食管癌组织(13/20)和25％正常食管粘膜组织(5/20)存在MT-3基因CpG岛超甲基化，而5例正常食管粘膜均未发生超甲基化(0/5)，提示MT-3基因超甲基化与食管癌发生之间有统计学意义(X<'2>=6.465，P=0.011)。 3 40％食管癌组织(8/20)和65％正常食管粘膜组织(13/20)存在MT-3基因表达，而5例正常食管粘膜组织均有表达，提示MT-3 mRNA表达与食管癌之间无统计学意义(X<'2>=2.506，P=0.113)。 4 MT-3 mRNA表达率在甲基化肿瘤组织与非甲基化肿瘤组织分别为23.1％和71.4％，甲基化肿瘤组织中MT-3 mRNA表达率低于非甲基化肿瘤组织，二者比较有统计学意义(X<'2>=4.432，P=0.035)；MT-3 mRNA表达率在甲基化正常食管粘膜组织与非甲基化正常食管粘膜组织分别为20％和80％，正常食管粘膜组织中MT-3 mRNA表达率甲基化组低于非甲基化组，二者比较亦有统计学意义(X<'2>=5.934，P=0.015)。 5 根据术后病理资料，食管癌组织中呈高/中度组织分化者MT-3基因甲基化率为46.2％(6/13)，低分化者甲基化率为100％(7/7)，二者比较有相关性(X<'2>=5.799，P=0.016)。分化程度越低，甲基化的比率越高；甲基化与患者的性别、年龄、吸烟、饮酒和肿瘤的分期均无关。 结论： 1 食管癌组织中MT-3基因CpG岛甲基化率明显高正常食管粘膜组织。 2 食管癌组织中MT-3基因CpG岛甲基化明显抑制了该基因的表达。 3 食管癌中MT-3基因作用的性质类似于抑癌基因，该基因的甲基化可能与食管癌的发生与发展有关。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述：DNA甲基化的研究方法

致谢

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