CTGF和TGF-β1对STZ诱导的糖尿病大鼠心肌病变的影响及洛汀新的干预作用

摘要

目的：心血管病变是糖尿病患者的主要死亡原因，约80％的糖尿病患者死于心血管并发症。糖尿病心肌病(diabetic cardiomvopamy，DCM)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是糖尿病的一个独立并发症。其特征性的病理改变为心肌细胞外基质(ECM)集聚和心肌间质重构，表现为心肌肥厚和心肌纤维化。临床特征早期以心脏舒张功能不全、晚期以心脏收缩功能障碍为主。多种研究发现高血糖导致的代谢紊乱是DCM的始动因素，细胞功能改变、多种细胞因子和蛋白、酶等都参与了DCM的发生发展。由于其病因复杂，病理生理改变独特，症状不显著，且缺乏特异的诊断标准，故临床研究及早期干预治疗有一定困难。 本研究目的旨在： 1 建立大鼠2型糖尿病心肌病模型；2 探讨DCM动物模型心肌组织超微结构变化；3 明确一种新发现的促纤维化生长因子-结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病心肌病发病中的作用，及其与血管紧张素Ⅱ、转化生长因子-β(TGF-βl)的关系，进一步阐明DCM的发病机制，寻找和发现有效防治糖尿病心肌病的新方法。 方法： 1．大鼠2型糖尿病心肌病模型的制备选用清洁级、健康雄性8周龄Wistar大鼠45只，体重199±14g。适应性喂养2周，随机分为两组，正常对照组15只和实验组30只，按高脂饮食+小剂量STZ(streptozotocin)制造2型糖尿病模型，成模后继续喂养8周使发生糖尿病心肌病变。正常对照组给予常规饲料喂养；实验组给予高脂高热量饲料喂养。喂养8周后，测两组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、血清甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)，以李氏自我平衡模型分析法(homeostasis model assessment，HOMA)指数作为评价胰岛素抵抗指标。出现胰岛素抵抗的实验组大鼠再给予小剂量STZ 30mg/kg(STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中，pH值4.2)腹腔注射，正常对照组给予相同剂量的柠檬酸缓冲液腹腔注射。2周后实验组大鼠行葡萄糖糖耐量(OGTT)试验，以空腹血糖≥7.8mm0l/L和(或)餐后2小时血糖≥11.1 mmol/L作为糖尿病模型组。成模型的实验组大鼠再随机分为两组：糖尿病心肌病组和洛汀新干预组。继续原饮食方案喂养8周。 2．血糖、胰岛素、血脂测定大鼠禁食水12小时后空腹内眦静脉取血，分离出血清用葡萄糖氧化酶法测血糖，放射免疫法测胰岛素。采用稳态模型(Homeoestasis Model Assessment, HOMA)及胰岛素敏感指数(Insulin Sensitivity Index，ISI)评价胰岛素抵抗程度。比色法测定甘油三酯(triglycerid，TG)、总胆固醇(totalch01ester01e，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity1ipoprotein-ch01esterole，HDL-C)。低密度脂蛋白胆固醇 (lowerdensity lipoprotein-ch01esterole，LDL-C) 由Friedewald式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出(以mol/L计)。Cu<'+>比色法测定游离脂肪酸(FFAs)含量。 3．免疫组织化学染色比较CTGF和TGF-βl在三组大鼠心肌中的表达实验组大鼠再随机分成2组：糖尿病心肌病组和洛汀新干预组。洛汀新干预组大鼠给予洛汀新10mg/kg/d灌胃，正常对照组和糖尿病心肌病组给予相同剂量蒸馏水灌胃。继续喂养8周后处死大鼠取心肌组织经4％多聚甲醛固定、石蜡包埋，用于形态学观察和免疫组化(电镜标本用4％戊二醛固定，树脂包埋)。应用免疫组化观察比较正常对照组大鼠、洛汀新干预组大鼠与糖尿病心肌病组大鼠心肌中CTGF和TGF-β1表达差异。 4．心肌细胞形态学检查常规方法制备大鼠心肌光镜及电镜组织切片，行HE、vG染色观察比较大鼠心肌细胞形态和心肌间质胶原的变化，透射电镜观察心肌细胞超微结构变化。 5．统计学处理所有数据用SPSS12.0软件处理，计量资料以均数士标准差表示，组间差异用两样本均数比较的t检验进行比较，两组以上比较采用单因素方差分析作统计学处理。检验的显著性用P值表示。P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。 结果： 1．大鼠体重的变化实验初，大鼠随机分组，各组体重无统计学差别，具有可比性。8周后，即STZ注射前，与正常对照组相比，实验组大鼠体重明显升高(P<0.01)。 注射STz后，糖尿病心肌病组及洛汀新干预组大鼠体重增长减慢。试验末，糖尿病心肌病组与洛汀新干预组大鼠体重无显著差别(p>0.05)，但与正常对照组相比，两组大鼠体重仍明显增高(p<0.05)。 2．各组大鼠生化指标比较实验8周末，实验组大鼠与正常对照组相比空腹血糖无显著差别，但胰岛素水平明显高于正常对照组(P<0.01)，胰岛素敏感指数明显下降，出现胰岛素抵抗；血清TC、TG、LDL及FFA均较正常对照组明显升高(P<0.01)。 试验末，与正常对照组大鼠相比，糖尿病心肌病组和洛汀新干预组大鼠空腹血糖显著升高(P<0.01)，空腹胰岛素无显著差异(p>0.05)；胰岛素敏感指数仍明显下降(P<0.01)；血脂水平仍明显升高(P<0.01)。 3．心肌细胞形态及胶原实验末，与正常对照组相比，糖尿病心肌病组大鼠心肌细胞稀疏、肿大；心肌间质胶原明显增多；心肌细胞超微结构发生了显著病变。洛汀新干预组心肌细胞形态、胶原量及超微结构均明显好转，但仍较正常对照组仍差。 4．各组大鼠心肌CTGF、TGF-βl表达水平CTGF主要存在于心肌间质，TGF-βl主要存在于心肌细胞胞浆，免疫组化染成棕黄色。 CTGF：正常对照组大鼠心肌间质细胞及血管周围CTGF呈弱阳性表达；糖尿病心肌病组大鼠心肌间质细胞及血管平滑肌细胞呈强阳性表达；洛汀新干预组心肌间质CTGF明显减少，但仍较正常对照组表达多。 TGF-βl：正常对照组大鼠心肌细胞浆有散在黄色物质，呈弱阳性改变。糖尿病心肌病组大鼠心肌细胞胞浆中及细胞周围、血管周围出现多的棕黄色颗粒物质，成强阳性反应。 洛汀新干预组大鼠心肌细胞胞浆中和胞周、血管周围棕黄色颗粒物质较糖尿病心肌病组大鼠明显减少，但是较正常对照组仍有增多。 结论： 1 大鼠2型糖尿病模型制备采用高脂饮食使大鼠肥胖产生高血脂及胰岛素抵抗，然后给予小剂量STZ腹腔注射部分破坏胰岛B细胞使胰岛素逐渐减少最终发生糖尿病。其发病过程及特征符合人类2型糖尿病临床过程及代谢特征，具有中度高血糖、高血脂及胰岛素抵抗。并且持续的高血糖成为糖尿病心肌病变发生的内环境因素。 2 试验末，糖尿病心肌病组大鼠心脏重量增加，心肌肥厚，心肌细胞形态及超微结构发生明显病变，心肌间质胶原增多，CTGF、TGF-β1表达水平明显高于正常对照组，洛汀新干预后CTGF及TGF-β1水平下降且有统计学意义，并且心肌形态学也明显好转，说明洛汀新对糖尿病心肌有保护作用。 3 糖尿病心肌病组及洛汀新干预组大鼠血脂血糖水平无明显差别但均明显高于正常对照组，说明洛汀新对糖尿病心肌的保护作用是独立于降血脂血糖作用之外的。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附表

附图

讨论

结论

参考文献

综述结缔组织生长因子对糖尿病心肌病的影响及ACEI保护作用的研究进展

致谢

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