络气虚滞型血管内皮功能障碍的病理生理基础及通络方药干预研究

摘要

目的：本研究以络病理论为指导，以血管内皮功能障碍为切入点，建立病证结合络气虚滞中医证候动物模型与细胞模型，从整体与细胞水平探讨络气虚滞型血管内皮功能障碍的病理生理基础，并研究不同类别通络方药的干预作用。 血管内皮功能障碍(endothelial dysfunetion，ED)系血管内皮细胞在多种病理因素(如高血压、高血脂、糖尿病、吸烟、压力等)刺激下失去正常功能的病理过程，与氧化应激、免疫损伤及炎症机制关系密切，主要表现为内皮依赖性舒张功能障碍及血管活性物质分泌紊乱，是心脑血管病发生的始动因素和重要环节。 中医学认为血液在血管中正常运行需要气的推运，气虚运血无力或气滞血运不畅均可导致血液运行障碍及血管病变。基于络病理论研究的“三维立体网络系统”，广义络脉分为气络和脉络，脉络运行血液，其解剖形态与现代医学血管系统具有同一性，由此而提出“脉络—血管系统病”(vessel-collateral and vascular system disorders，VCVSD)概念；气络运行经气，发挥温煦充养、防御卫护、信息传导、调节控制作用。络气虚滞(stagnancy of collateral-qi in a deficiency condition，SCQDC)是脉络病变由功能性病变向器质性病变发展的早期阶段，其引起的脉络自适应、自调节、自稳态功能失常，为“脉络—血管系统病”(vessel-collateral and vasctllarsystem disorders，VCVSD)始动因素并贯穿和影响病变的全过程，与血管内皮功能障碍具有内在一致性，也涵盖了西医学更广泛的神经-内分泌-免疫网络调节功能异常对血管病变的影响。这启发我们将中医气血相关的络病理论特色与现代微观研究有机结合，探讨“络气虚滞”状态下NEI 网络调控失常变化规律及其与血管内皮功能障碍之间的内在联系，并探索不同类别通络方药的干预机制。 方法：本研究采用同型半胱氨酸制作血管内皮功能障碍的基础模型，在此基础上应用“基础进食+强迫负重游泳”诱发气虚证候的方法，建立络气虚滞型血管内皮功能障碍病证结合的动物模型。以通过临床流行病学调查建立的“脉络—血管系统病”证候诊断标准为基准，分别从中医证候学、血管内皮功能变化及血管舒缩反应性改变等方面对所建模型进行评价，并应用单味益气中药、益气活血组分配伍方药、通络复方从不同层次进行通络反证。以此为实验平台，探讨络气虚滞状态下NEI 网络的变化规律及其与血管内皮功能障碍之间的内在相关性，以及通络方药改善血管内皮功能的作用机制。同时培养人脐静脉内皮细胞株ECV-304，通过加入络气虚滞型内皮功能障碍模型大鼠血清，建立体外络气虚滞型内皮细胞损伤模型，并应用上述不同通络方药进行干预，在细胞水平上进一步探讨络气虚滞型血管内皮细胞的损伤机制及通络方药的影响。 本实验建立了络气虚滞型内皮功能障碍病证结合动物模型，应用生物信息学方法探讨了络气虚滞型血管内皮功能障碍与 NEI 网络相关的病理生理学基础及可能的信号转导机制，并探讨了不同类别通络方药干预机制，为运用通络方药防治心脑血管病提供实验依据。 1．本研究以近年来社会心理因素对人体造成的超负荷压力在各种急性心脑血管病发生中的影响为立题背景，以络气虚滞型血管内皮功能障碍临床证候诊断标准为依据，首先采用高蛋氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症建立血管内皮功能障碍模型，以“基础进食+强迫负重游泳”法诱发气虚证候，并以人参、双参、通心络超微粉三种通络药物进行干预，建立络气虚滞病证结合动物模型，观察并记录实验动物的证候学表现、检测血管内皮功能及血管内皮依赖性舒张反应的变化。实验结果显示，所建动物模型表现出了明显的络气虚滞证候特征，同时血管内皮功能及内皮依赖性舒张反应显著下降，三个层次的通络干预可使上述病、证得到不同程度的改善，而且与“脉络—血管系统病”络气虚滞型血管内皮功能障碍的临床证候诊断标准基本吻合，表明模型成功。 2．实验结果提示，HCY组血管内皮功能受损，AngⅡ明显升高，但络气虚滞型内皮功能障碍与HCY组比较，AngⅡ升高更为明显，差异显著，显示络气虚滞是AngⅡ上升的重要因素。同时看到，肾素、醛固酮下降，RAAS系统并未激活，而NE与AngⅡ呈现出同步升高的密切关系，提示交感神经兴奋可能是AngⅡ升高的主要原因，这反映“过劳伤气”所致植物神经功能失调可能在血管病变中起着重要作用。而 NEI 网络调节功能出现了严重紊乱，主要表现为下丘脑机能偏亢，受其调节的垂体功能反而低下，同时该功能轴靶腺肾上腺皮质功能也表现出低下，提示NEI网络的稳态失衡可能与络气虚滞型血管内皮功能障碍发生发展具有密切关系。 3．生物信息学的研究结果表明，络气虚滞组 NEI 网络指标和内皮功能障碍指标之间可以形成相互独立的子系统(如：ET与CRH、ACTH、GC及ALD；AngⅡ与ET、IL-1；PGI2与ALD；NO与ALD分别是4个相互独立的系统)，这些子系统是按照复杂系统最优化原则发生相互联系，而正常对照组、HCY组、通络干预组不存在这种子系统之间的相互联系，提示过劳伤气是导致 NEI 网络紊乱的主要因素，络气虚滞型血管内皮功能障碍可能与 NEI 网络稳态失衡存在着密切相关性，后者可能是该状态下血管内皮功能障碍发生、发展的病理生理学基础之一。2005 年本课题启动时经中国医学科学院医学信息研究所查询MEDLINE(1966.1～2005.6)、PubMed(2005．1～2005．6)、中国生物医学文献数据库(1978．1～2005．4)、中文生物医学期刊文献数据库(2005．1～2005．6)文献，仅有神经、内分泌、免疫分系统与血管病变相互关系的文献报道，未见 NEI 网络调节功能失常对血管病变影响的报道。尽管本研究仅部分揭示 NEI 网络功能失调对血管内皮功能障碍的影响，但由于 NEI 网络作为多维立体调控网络在保持人体稳态机制中的重要作用，深入探讨其对血管病变影响及其内在规律需要引起重视。 4．整体动物模型研究发现，络气虚滞型血管内皮功能障碍 COHb 含量显著下降，HO-1mRNA和蛋白表达下调，同时JNK和c-Jun mRNA及JNK和磷酸化c-Jun蛋白水平均显著降低，提示络气虚滞型血管内皮功能障碍HO-1/CO 系统被抑制。以络气虚滞血管内皮功能障碍动物模型血清干预体外培养人脐静脉内皮细胞，建立细胞损伤模型，进一步从细胞水平上证实了络气虚滞动物模型所引起的HO-1/CO系统被抑制与JNK/c-Jun信号转导通路相关。 5．整体及细胞水平的研究结果显示，通络方药可明显升高NO，降低ET，改善血管内皮超微结构，同时可降低CRH、AngⅡ及IL-6 等水平，升高血浆肾素、醛固酮及糖皮质激素等水平，基于生物信息学分析结果，络气虚滞型血管内皮功能障碍动物模型 NEI 网络指标与血管内皮功能障碍指标之间具有密切联系，上述结果显示，通络方药不仅可直接改善血管内皮功能，而且还可通过调节 NEI 网络发挥改善内皮功能的作用，其机制可能与通络方药升高COHb，上调HO-1表达以及与其相关的JNK/c-Jun信号通路的活性有关。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分络气虚滞血管内皮功能障碍模型的建立及通络方药的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图(一)

附图(二)

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分络气虚滞型血管内皮功能障碍模型大鼠NEI网络变化及通络方药干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分络气虚滞大鼠动脉组织JNK/c-Jun/HO-1/CO通路的变化及通络方药的干预作用

一、络气虚滞大鼠胸主动脉HO-1/CO的改变及通络方药的干预作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

二、JNK/c-Jun通路在络气虚滞大鼠动脉组织中的变化及通络方药对此的影响

前言

材料与方法

结果

附图(一)

附图(二)

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分络气虚滞动物模型血清诱导ECV-304细胞中JNK/c-Jun/HO-1表达的变化及通络方药的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一心气虚证动物模型的研制及其评价体系构建概况

综述二血管内皮功能障碍的研究概况

致谢

个人简历