重组腺相关病毒载体介导的人类缺氧诱导因子-1α抑制Aβ神经毒性作用的实验研究

摘要

基因治疗是二十世纪八十年代以后发展起来的一种疾病治疗模式，其定义是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高新技术。近年来，随着基因治疗技术曰趋成熟，基因治疗范围已从遗传病扩展到非遗传病领域，例如肿瘤，传染病，免疫缺陷病，神经系统疾病等，尤其阿尔茨海默病fAlzheimet’s disease，AD)的基因治疗目前倍受学者关注，并且已获得初步成效。其中选择适当的病毒载体将具有治疗价值的基因导入神经细胞并使其有效表达是AD基因治疗研究的关键所在。 腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体源于非致病的野生型腺相关病毒，安全性好，对人体无致病性，宿主范围广泛，免疫原性小，可通过将外源基因整合到宿主细胞染色体和/或转变成稳定的染色体外附加体形式介导外源基因的长期表达，是基因治疗研究中应用最为广泛的载体系统之一。 缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是一种在缺氧应答过程中起重要作用的核转录因子，广泛参与缺氧诱导的细胞适应性反应，已成为缺氧应答时基因表达的调节中心。缺氧时HIF-1α生成增加，通过调控糖酵解酶、促红细胞生成素、血管内皮生长因子和一些涉及细胞生存蛋白质等的表达，调节能量代谢，增加毛细血管网密度，改善组织血流供应，使细胞产生适应性反应，从而恢复机体内环境稳态。最近研究证实HIF-1α能够减弱淀粉样蛋白(β amyloid peptide，Aβ)对神经细胞毒性损伤作用；防止线粒体不可逆抑制剂3-硝基丙酸诱导C6神经胶质瘤细胞损伤以及氧化应激引起的皮层神经细胞凋亡，提示HIF-1α有可能成为治疗AD等神经系统疾病的一个新靶点。 基于以上分析，本研究选用AAV-2为基因载体，人类HIF-1 α cDNA为治疗基因，构建重组人类缺氧诱导因子-1 α腺相关病毒载体(rAAV-HIF-1 α)，深入探讨rAAV-HIF-1 α对A β 25-35 诱导原代培养海马神经细胞凋亡及AD动物模型影响的内在机制，为今后应用rAAV-HIF-1 α进行AD基因治疗奠定基础。 1 pSNAV-HIF-1α的构建及其转染对Aβ25-35 诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响 1.1 pSNAV-HIF-1α的构建及表达 目的：构建携带人类HIF-1 α基因腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF-1α，转染原代培养的海马神经细胞检测HIF-1α蛋白表达。 方法：采用限制性内切酶KpnⅠ、BamHI双酶切pBSKhHIF1 α T7质粒获取人类HIF-1 α cDNA全长，插入至pSNAV2.0质粒KpnⅠ、BglⅡ位点，获得携带人类HIF-1α基因的腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF-1α。实验分为3组：normal组：原代培养的海马神经细胞未作任何特殊处理；HIF-1α组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV-HIF-1α(磷酸钙共沉淀法)；vector组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV 2.0(磷酸钙共沉淀法)。转染3d后提取细胞核蛋白，Western blot检测HIF-1α蛋白表达。 结果：①酶切、PCR技术证实成功构建了pSNAV-HIF-1α；QWesternblot检测结果表明，转染3d后HIF-1α组(2176.044±110.56)细胞HIF-1α蛋白的表达量较normal组(812.96±54.27)、vector组(859.43±72.33)显著升高(P<0.05)，而normal组、vector组细胞相比HIF-1α蛋白表达无显著性差异。 结论：成功构建了携带人类HIF-1α基因腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF-1α，转染原代培养海马神经细胞能够高效表达HIF-1 α蛋白。 1.2 pSNAV-HIF-1α转染对A β 25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响 目的：观察pSNAV-HIF-1α转染对A β 25-35 诱导海马神经细胞凋亡的影响 方法：实验分为5组：normal组：原代培养的海马神经细胞未作任何特殊处理；normal+A β组：以终浓度为10μmol/LA β 25-35 处理原代培养海马神经细胞24h；vector组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV 2.0；vector+Aβ组：pSNAV 2.0转染3d后以终浓度为10μmol/LAβ 25-35 处理24h：HIF-1 α+A 13组：pSNAV-HIF-1 α转染3d后以终浓度为10μmol/L Aβ 25-35处理24h。采用流式细胞术检测海马神经细胞凋亡百分率。 结论：pSNAV-HIF-1 α转染能够抑制A β 25-35 诱导海马神经细胞凋亡。 2 重组人类缺氧诱导因子-1 α腺相关病毒载体的构建及表达 目的：构建重组人类缺氧诱导因子-1 α腺相关病毒载体(rAAV-HIF-1α)，转染原代培养海马神经细胞检测HIF-1 α蛋白表达。 方法：采用Lipofectamine 2000将pSNAV-HIF-1 Α转染BHK-21细胞，再经G418筛选、挑选 G418 抗性细胞克隆，得到的混合细胞株命名为BHK/pSNAV-HIF-1 α，即AAV载体细胞株。用具有AAV复制和包装功能的重组 1 型单纯疱疹病毒HSV1-rc/hUL2感染此细胞株，经氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提技术粗纯化AAV病毒，透析袋浓缩法进一步浓缩AAV病毒，即得到用于细胞实验的rAAV-HIF-1 α。采用PCR技术鉴定病毒。采用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV-HIF-1 α的物理滴度。采用凝胶扫描图象分析系统，分析rAAV-HIF-1α样品经10％的SDS-PAGE 电泳后所得蛋白条带测定病毒纯度。实验分为2组：normal组：原代培养的海马神经细胞未作任何特殊处理；rAAV-HIF-1 α组：原代培养的海马神经细胞转染rAAV-HIF-1 α；于转染3d后提取细胞总蛋白，Western blot检测HIF-1 α蛋白表达。 结论：成功构建了高滴度、高纯度的重组人类缺氧诱导因子-1 α腺相关病毒载体rAAV-HIF-1α，转染原代培养海马神经细胞能够高效表达HIF-1α蛋白，为进一步研究rAAV-HIF-1α神经保护机制奠定基础。 3 rAAV-HIF-1α转染对A β 25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响及机制初探 目的：应用rAAV-HIF-1α体外转染原代培养海马神经细胞，观察其对A β 25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响。 方法：实验分为以下3组：normal组：未作任何特殊处理的原代培养海马神经细胞；normal+A β组：以终浓度为10μmol/LA β 25-35 处理原代培养海马神经细胞24h；rAAV-HIF-1 α+A β组：rAAV-HIF-1 α转染3d后以终浓度为10μmol/L A β 25-35处理24h。采用透射电镜技术观察海马神经细胞凋亡形态学改变及流式细胞术检测海马神经细胞凋亡百分率。采用激光共聚焦扫描技术检测海马神经细胞钙离子浓度。 结论：rAAV-HIF-1α转染能够抑制A β 25-35 诱导海马神经细胞凋亡，其机制可能与HIF-1 α降低细胞内游离钙浓度，从而抑制凋亡级联反应有关。 4 侧脑室注射rAAV-HIF-1 α基因治疗AD模型鼠的实验研究 目的：在体观察侧脑室注射rAAV-HIF-1 α对AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响方法：健康雄性SD大鼠32只，体重250-300g，随机分为4组：normal组(n=8)：未作任何特殊处理；AD组(n=8)：右侧脑室(AP：-0.8mm，ML：1.5mm，DV：4.0mm)注射2μl A β 25-35(10mg/mL)；sham组(n=8)：右侧脑室注射2μl 生理盐水；AD+rAAV-HIF-1α组(n=8)：右侧脑室注射2μl A β 25-35后1周右侧脑室注射10μl rAAV-HIF-1α(1×10<'12>v.g./ml)。以上各组动物于注射A β 25-35 或生理盐水后5周取材检测海马神经细胞HIF-1α蛋白表达及凋亡百分率。 结论：侧脑室注射rAAV-HIF-1 α能够抑制AD模型大鼠海马神经细胞凋亡。 5 结语 本研究成功构建了重组人类缺氧诱导因子-1α腺相关病毒载体rAAV-HIF-1 α并证实其能够减弱A β神经细胞毒性作用，为今后应用rAAV-HIF-1α进行AD基因治疗奠定了基础。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分 pSNAV-HIF-1α的构建及其转染对Aβ25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 重组人类缺氧诱导因子-1α腺相关病毒载体的构建及表达

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 rAAV-HIF-1α转染对Aβ25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响及机制初探

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 侧脑室注射rAAV-HIF-1α基因治疗AD模型大鼠的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 缺氧诱导因子-1的研究进展

致谢

个人简历