CCK-8调节小鼠腹腔巨噬细胞B7.1、B7.2表达及其协同刺激功能的信号转导机制研究

摘要

胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是广泛分布于体内多个系统的神经肽，具有多种生物学功能，如调节摄食、焦虑、记忆等。我们在前一项国家自然科学基金项目(CCK抗炎作用的受体及信号转导机制研究No．30270529)的研究中发现，八肽 CCK (cholecystokinin octapeptide，CCK-8)具有一定的免疫调节及抗炎作用，CCK-8作用于表达CCK受体的巨噬细胞，通过激活cAMP-PKA来抑制PKC活性，从而抑制NF-kB活性，抑制脂多糖(lipopolysacctlaride，LPS)诱生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达，表明CCK-8 可调节天然免疫应答。但CCK-8对适应性免疫应答有何影响尚无报道。已有报道人Jurkat T淋巴细胞表达CCK-2受体及其mRNA转录，CCK mRNA在人淋巴细胞中有转录；CCK对植物血凝素PHA(phytohemagglutinin)诱导的人外周血淋巴细胞增生具有抑制性调节作用，对丝裂原-诱导的小鼠淋巴细胞增生及淋巴细胞的移动性也具有抑制作用，而对其自发性增生和粘附力则具有促进作用。CCK及CCK受体在淋巴细胞中表达，提示CCK可能通过自分泌或旁分泌的形式调节淋巴细胞的一些功能，参与适应性免疫应答。 本课题将以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，首先从体外和体内实验分别研究CCK-8对静息和LPS活化的巨噬细胞B7.1、B7.2表达和协同刺激活性的影响，并从受体、cAMP-PKA通路、转录因子NF-kB等多个层面，系统研究CCK-8对静息及LPS作用下小鼠腹腔巨噬细胞内CCKR-cAMP-PKA-NF-kB-B7.1和B7.2表达的这一信号转导通路的影响。深入探讨了CCK-8 通过干预巨噬细胞协同刺激分子的表达进而间接调节Th1/Th2平衡的机制。 1 CCK-8对巨噬细胞。B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响 体外应用CCK-8(10<'12>mol/L～lO<'-6>mol/L)孵育小鼠腹腔巨噬细胞一定时间，采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化。用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4<'+>T细胞，按4：1数量比与腹腔巨噬细胞(预先用CCK-8和/或抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、CCK1R拮抗剂CR1409、CCK2R拮抗剂CR2945孵育24h)共同体外培养，同时加入ConA 5mg/L，采用<'3>H掺入法测定CD4<'+>T细胞增殖程度以反映巨噬细胞的协同刺激活性。结果发现：CCK-8可上调静息巨噬细胞B7.1及B7.2的表达，并增强巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8的作用呈剂量依赖性，最大效应剂量是在10<'7>mol/L～10<'9>mol/L之间。抗B7.2抗体可减轻CCK-8增强巨噬细胞协同刺激活性的作用，CCK-8主要是通过上调巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性。 2 CCK-8对巨噬细胞B7.1和B7.2表达的信号转导通路的研究 NF-kB可以诱导协同刺激分子B7.1 (CD80)和B7.2(CD86)的表达。巨噬细胞是体内重要的炎性和免疫效应细胞，而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是诱导巨噬细胞产生和释放炎症介质最强烈、最有效的激活物。研究表明，LPS可激活巨噬细胞cAMP-PKA信号通路并介导了一个抑制性信号，它可能抑制巨噬细胞表达～系列细胞因子，下调TNF-α和IL-1β的释放量。我们的研究证实CCK-8作用于表达CCK受体的巨噬细胞，通过激活cAMP-PKA、抑制PKC活性而抑制NF-kB活性，从而抑制脂多糖诱生促炎细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6。CCK-8是否通过CCKR-cAMP-PKA-NF-kB通路调节巨噬细胞B7.1和B7.2的表达，目前尚未见报道。 据此，本部分实验将主要观察CCK-8调节静息巨噬细胞和LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达的细胞内信号转导通路。本部分采用FACS检测巨噬细胞B7.1和B7.2的表达，[<'3>H]掺入法测定CD4<'+>T细胞增殖程度以反映巨噬细胞的协同刺激活性。ELISA 法检测细胞内cAMP含量和PKA活性，EMSA检测小鼠腹腔巨噬细胞内NF-kB活性，Western blot检测小鼠腹腔巨噬细胞内IkB-α和p-IkB-α蛋白水平的变化。 (二)、CCK-8通过激活巨噬细胞内cAMP-PKA通路调节NF-kB活性，进而调节B7.1和B7.2表达 (1)用LPS孵育小鼠腹腔巨噬细胞15min或30min，细胞内cAMP含量及PKA活性升高，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。 (2)在静息状态下，与对照组比较，Fsk(forskolin，cAMP 激动剂毛喉素)组可以增加巨噬细胞内cAMP含量及PKA活性(P<0.05)。 (3)用不同刺激因素孵育小鼠腹腔巨噬细胞60min，与control 组相比，LPS可以可以升高细胞内P-IkB-α蛋白表达及增强NF-kB 活性(P<0.05)。 (三)、CCK-8通过CCK受体调节cAMP-PKA-NF-kB-B7信号通路 (1)体外实验中，CCK1R拮抗剂CR1409及CCK2R拮抗剂CR2945均可逆转CCK-8作用下增强的巨噬细胞协同刺激活性和逆转CCK-8对LPS活化的巨噬细胞协同刺激活性的抑制作用，而且相同浓度的CR1409和CR2945相比较，CR1409的作用强于CR2945，表明CCK1R、CCK2R共同介导了CCK-8调节静息及LPS活化的巨噬细胞协同刺激活性的作用，并且CCK1R起主导作用。 (2)CCK-8显著抑制了LPS诱导的巨噬细胞中IkB磷酸化及NF-kB活性增高，对NF-kB活性的抑制率达37.26％(P<0.05)。 本研究分别从体内实验和体外实验入手，首次系统研究了CCK-8 对静息及LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响，并从受体、c．AMP-PKA、转录因子NF-kB等多个层次系统研究了CCK-8调节小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达的信号转导机制，深入揭示了CCK-8发挥免疫调节作用的机制。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分CCK-8对巨噬细胞B7.1、B7.2表达及其协同刺激功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分CCK-8对巨噬细胞B7.1、B7.2表达的信号转导通路的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分体内试验CCK-8对巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结语

综述 B7-CD28家族成员的免疫调节功能及其最新研究进展

致谢

个人简历