IL-6和STAT-3在胃癌中表达关系及双膦酸盐药物抑癌机制的研究

摘要

目的：在我国，胃癌是严重威胁人们健康的疾病。在肿瘤细胞增殖、浸润或转移过程中，肿瘤抗原刺激免疫细胞产生和分泌较多的内源性IL-6(interleukin-6，IL-6)，IL-6在肿瘤细胞中的过量表达又可以促进多种细胞的增殖和分化，即内源性的IL-6水平升高与肿瘤的发生、发展密切相关。 IL-6 的信号主要通过JAK/STATs途径与P21ras/MARK/NF-IL6途径转导至核内。在JAK/STATs途径中，IL-6主要激活信号传导与转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT-3)，STAT-3与多种肿瘤的发生、发展密切相关。多项研究表明，STAT-13通过磷酸化激活后，可导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤的形成和发展。IL-6信号的传导是通过JAK激酶的介导作用使STAT-3发生酪氨酸磷酸化反应而活化[6]。从而形成STAT-3/3同二聚体而转入细胞核，与II型IL-6反应成分(II-6reactive elemen，tIL-6RE)结合并诱导某些反应基因的表达。因此，在人胃癌细胞株中进行有关IL-6与p-STAT-3信号传导功能关系的研究，有助于阐明JAK/STAT信号途径在胃癌发病机制中所起的重要作用。 双膦酸盐类药物(Bisphosphonates，BPs)是用于各类骨疾患及钙代谢性疾病的一类新药物，最近有研究发现BPs能抑制多种癌细胞系的生长，主要通过抑制羟戊酸旁路的关键酶-焦磷酸法尼酯合酶，减少蛋白质异戊烯化及胞内的信号蛋白的激活，同时抑制肿瘤细胞增殖。为探讨IL-6、STAT-3与胃癌发生的关系及BPs的作用机制，本研究采用免疫组织化学，Western blot方法分别检测了42例临床手术切除胃癌及相应对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。同时采用流式细胞术、免疫细胞化学染色、Westernblot等方法研究分析，双磷酸盐类药物对体外培养的人胃癌细胞株IL-6、p-STAT-3蛋白表达的影响。为进一步探讨BPs的抗肿瘤作用机制及指导临床用药治疗提供实验依据。 材料与方法： 1.材料 1.1 收集河北医科大学第二医院胃肠外科2006年1月-2007年12月42例手术切除新鲜胃癌组织及相应远残端黏膜部位胃组织(距肿瘤＞10cm)作为对照，所有癌组织均经病理医师确定诊断证实，术前均未接受放疗或化疗。 1.2 人胃癌细胞株SGC-7901。 1.3双膦酸盐类药物(BPs)： IB(伊班膦酸钠)； 代号：Cp化合物(含氮磷键的双膦酸化合物，化学名称为[2-(6-氨基-嘌呤-9-基)-1-羟基.膦酰乙基]膦酸，后均简称Cp)。 2.方法 2.1 应用免疫组织化学技术(SP法)检测胃癌及对照组织中IL-6、p-STAT-3蛋白的表达。 2.2 分别提取胃癌及对照组织总蛋白采用蛋白印迹法(Western blot)检测胃癌及对照组织IL-6、p-STAT-3蛋白表达。 2.3 甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组SGC-7901细胞株的增殖情况，以确定半数抑制浓度(IC50)。设立空白对照组、溶剂对照组、药物实验组；药物浓度：IB：90、 120、150、180、210mol/L； CP：90、 120、150、180、210mol/L。分别于药物作用72 h后测定IOD值，计算细胞生长抑制率，根据IC50=Lg-1(Xm-μ∑P-0.5))，确定IC50(IB：220μmol/L， CP：150μmol/L)。 2.4 两种药物以IC50浓度分别作用细胞72h后收集细胞。流式细胞定量检测技术(FCM)检测细胞凋亡率的变化。 2.5分别选取两种药物的三个不同浓度，IB：160ktmol/L、220/μmol/L、280μmol/L；CP：90μmol/L、150μmol/L、210μmol/L作用于SGC-7901细胞株，FCM检测药物作用24h、48h、72h后细胞周期的变化。 2.6 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测两种药物以IC50浓度分别作用24h、48h、72 h，细胞中IL-6，p-STAT-3蛋白的表达情况。 2.7 免疫细胞化学法(sP法)观察药物作用72 h细胞IL-6、p-STAT-3蛋白表达情况的变化。 结果： 1.免疫组织化学结果IL-6主要为胞浆着棕黄色，p-STAT-3胞浆和胞核均着棕黄色。在42例对照组织中IL-6阳性表达率为9.62％(3/42)，p-STAT-3未见表达。在42例胃癌组织中IL-6和p-STAT-3表达的阳性率为73.81％(31/42)和35.71％(15/42)明显高于对照组织（P＜0.05)。IL-6，p-STAT-3两种蛋白表达水平之间呈显著正相关关系(X2=10.227 P＜0.05)，癌组织中IL-6蛋白表达分别与淋巴结转移、浸润深度有显著相关性(P＜0.05)，在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中，IL-6的表达阳性率明显增高；而与患者性别、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度无相关性(P＞0.05)；p-STAT-3蛋白表达分别与淋巴结转移、肿瘤分化程度有显著相关性(P＜0.05)，在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高，而与患者性别、肿瘤组织学类型、浸润深度无相关性(P＞0.05)。 2.Western Blot检测结果β-actin、IL-6、p-STAT3蛋白分子量为42KD、26kD、90kD，Western杂交后在相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对杂交条带进行半定量分析，蛋白含量以积分光密度值(IOD)表示。每次检测蛋白时均以β-actin蛋白为内参，以相对积分光密度比较蛋白表达高低。与对照组织相比，42例有33例出现胃癌组织中IL-6蛋白高表达，其高表达率为78.57％，有27例出现p-STAT3蛋白高表达，其高表达率为64.28％。 3.IB、CP对SGC-7901细胞株增殖的影响两种药物均可抑制SGC-7901细胞增殖，药物浓度和作用时间不同其抑制作用不同。随着药物浓度增加，作用时间延长，抑制作用逐渐增强，210μmol/L的CP和IB作用72 h的抑制率分别达76.43％、51.71％。溶剂对照组与空白对照组细胞未见明显变化(P＞0.05)。IB的IC50为220μmol/L，CP的IC50为150μmol/L。 4 流式细胞术检测结果两种药物均可诱导SGC-7901细胞株凋亡，药物实验组SGC-7901细胞DNA直方图二倍体峰前均可见凋亡细胞特征性的亚二倍体峰(Fig.1-3)，对照组未见凋亡峰。IB组与CP组凋亡率均高于对照组(P＜0.05)，提示BPs可促进胃癌细胞株凋亡，两种药物组之间细胞的凋亡率无显著差异(P＞0.05)。两种药物对于细胞周期的影响均显著大于对照组(P＜0.05)，随着药物作用时间的延长，药物浓度的增加，S期细胞数逐渐增加，G0/G1期和G2/M期细胞数逐渐减少。CP组作用强于IB组(P＜0.05，Table 3)。由此可见，BPs可以将细胞阻滞于S期，且有明显的量效和时效关系。 5 免疫细胞化学结果光镜下观察IB、CP作用于SGC-7901细胞72h后，IL-6、p-STAT-3蛋白表达与对照组比较均降低CP作用强于IB。 6 Western Blot检测结果随着BPs作用时间延长IL-6，p-STAT-3蛋白表达量逐渐降低，药物作用时间与表达量呈负相关(r=-0.627，r=-0.738，P＜0.05)。CP组作用强于IB组，两者与对照组比较，均有显著性差异(P＜0.05)。 结论: 1.在胃癌组织中IL-6、p-STAT-3呈现高表达，两者之间有显著正相关关系，在淋巴结转移或侵入浆膜的胃癌组织中，IL-6蛋白表达阳性率明显增高；在淋巴结转移或分化程度低的胃癌组织中p-STAT-3蛋白表达阳性率明显增高。 2.双膦酸盐类药物抗肿瘤作用机制为通过调节IL-6使STAT-3蛋白活化受抑制，降低磷酸化STAT-3蛋白表达，从而减低p-STAT-3细胞的促进增殖和抑制凋亡的作用，进而抑制肿瘤。 3.双膦酸盐类药物可诱导肿瘤细胞凋亡，还可通过延长细胞周期，抑制肿瘤细胞的增殖。 4 IB与CP比较，CP对人胃癌细胞株SGC8901细胞周期的影响和降低细胞中IL-6、p-STAT-3蛋白表达的作用均明显强于IB。

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声明

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 细胞因子IL-6蛋白和转录因子STAT-3在胃癌细胞株中表达的相关性研究及双膦酸盐的抑癌机制

致谢

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