种植胎兔雪旺细胞同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验研究

摘要

目的：通过将体外培养提纯的胎兔雪旺细胞种植到经化学萃取处理的去细胞同种异体神经段中制成的桥接复合体移植到兔缺损的坐骨神经上，观察移植神经周围免疫细胞的变化以及坐骨神经的再生、功能恢复情况。探讨种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经移植促进神经再生和功能恢复的作用和机制，证实此种桥接复合体免疫原性非常小，既能为再生神经提供良好的支架作用，又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生，为临床上应用同种异体神经修复周围神经缺损提供理论依据。 方法：1.雪旺细胞的培养：取怀孕28天的新西兰白兔，耳缘静脉注入空气处死后迅速取胎兔。应用手术显微镜在无菌条件下取胎兔坐骨神经，尽量去除神经外膜及束膜，Hank’s液冲洗5遍后将神经剪碎。使用双酶消化法(trypsin/collagenase)培养雪旺细胞，利用双差速贴壁法及Arab-C(终末浓度10-5mmol/L)抑制和去除成纤维细胞，提纯后使用NGF(40ng/ml)促进SC细胞生长。在倒置显微镜下观察细胞生长情况并接种进行传代，收集生长良好的第二代细胞计数并应用S-100蛋白免疫组化鉴定。雪旺细胞的培养与观察：经传代的雪旺细胞在倒置相差显微镜下计数并观察细胞形态：雪旺细胞的浓度已达到1×108/ml，其典型形态呈梭形，有突起，多为双极，偶见三个细胞突起。胞核明显，呈卵圆形。细胞呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏样排列生长。视野内仍可见少量成纤维细胞，胞体较雪旺细胞大，扁平状外形不规则，突起短而多，核仁明显，有2-3个核仁，颜色较雪旺细胞浅。2.去细胞同种异体神经移植物制备：取成年健康新西兰白兔，分别于梨状肌下缘水平以远切取双侧坐骨神经，作为异体神经的来源。神经萃取前先在手术显微镜下去除其表面的脂肪组织及部分神经外膜，并将其分为3cm的小段，然后置于4℃蒸馏水中静置6h，再将神经段放入3％TritonX-100溶液中静置12h，然后置于蒸馏水中震荡，漂洗6h。如此反复，TritonX-100共作用时间为96h，4℃下保存，用于神经移植。对萃取的神经段行石蜡切片HE染色及扫描电镜观察去细胞的情况。去细胞神经桥接体的观察：大体观察：神经萃取过程中可见两端及周围有絮状物析出，萃取后神经呈淡乳白色，无光泽，其外径及长度较新鲜神经稍减小，柔软，有韧性。HE染色光镜观察：神经纤维结构消失，红染的神经内膜呈波浪状纵形排列，形成管柱状空隙。扫描电镜观察：神经内的轴突、髓鞘已被完全去除，可见由胶原纤维构成的立体管状结构，部分管腔不规则。胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征，管内并可见膜样结构，为雪旺细胞基底膜。3.种植雪旺细胞同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验观察：将培养的第二代雪旺细胞以1×108/ml的浓度用100ul的微量注射器注入去细胞神经段内，形成同种异体神经复合体，然后将此复合体迅速移植到兔缺损的一侧坐骨神经(实验组)，对照组移植未注入雪旺细胞的去细胞同种异体神经，术后1周、4周、8周光镜观察移植段坐骨神经周围肌肉组织中免疫细胞的浸润情况，计数每个高倍视野免疫细胞的数量。术后4周、8周、16周大体观察兔的足部溃疡形成及愈合情况，肉眼观察神经愈合情况；光镜观察坐骨神经再生和髓鞘形成情况；电镜观察神经再生和髓鞘形成情况以及轴索、线粒体、微管、微丝和雪旺细胞等超微结构的变化；应用图像分析系统对再生神经纤维数目、有髓神经纤维轴突直径、髓鞘厚度进行量化分析；测量小腿三头肌湿重；最后进行统计学分析。结果：种植胎兔雪旺细胞同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验观察：术后两组动物手术区局部均未出现明显的排斥反应，术后1周移植段坐骨神经周围肌肉组织中有淋巴细胞及巨噬细胞浸润，实验组明显多于对照组；术后4周，浸润的免疫细胞两组均较1周后明显减少，实验组减少的更明显。术后8周，浸润的免疫细胞更加减少。术后1周，实验组和对照组有显著差异，而术后4周、8周两组之间没有显著差异。实验组足部溃疡的愈合情况、再生神经纤维数目、有髓神经纤维轴突直径、髓鞘厚度均优于对照组。小腿三头肌湿重于术后4周实验组与对照组无明显差异，术后8周、16周实验组恢复优于对照组。 结论：采用双酶消化法和双差速贴壁法培养和提纯雪旺细胞并辅以神经生长因子(NGF)可获取足够浓度的雪旺细胞。用3％Triton X-100作用96小时后可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的基底膜管和纤维支架结构。种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体免疫原性非常小，不仅能够能为再生神经提供良好的支架作用，又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生，对坐骨神经缺损后的神经再生以及功能恢复有更加有效的促进作用。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 周围神经损伤再生与同种异体神经移植的研究进展

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