种植雪旺细胞的同种异体神经桥接复合体修复兔坐骨神经缺损免疫排斥的实验研究

摘要

目的：将体外培养提纯的胎兔雪旺细胞种植到经化学处理的脱细胞同种异体神经段中制成桥接复合体。然后将桥接复合体移植到成年兔缺损的坐骨神经，观察坐骨神经的再生及功能恢复情况及有无免疫排斥反应，从而证实桥接复合体既能为再生神经提供良好的支架作用，又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生，并且证实神经桥接复合体的抗原性小或无，为临床上更加合理治疗周围神经损伤提供理论基础。 方法：1、胎兔雪旺细胞的培养：取怀孕28天的新西兰白兔，处死后迅速取胎兔。在手术显微镜下无菌条件下取胎兔双侧坐骨神经，尽可能剥除神经外膜及束膜后将其剪碎。采用双酶消化法(trypsin/collagenase)和双差速贴壁法培养和提纯雪旺细胞，并辅以神经生长因子(NGF)促进雪旺细胞的生长。倒置相差显微镜下观察雪旺细胞的生长情况，并接种进行传代，收集生长良好的第二代细胞计数并应用S-100蛋白免疫组化鉴定。2、去细胞神经桥接体的制备：取成年健康新西兰白兔，自梨状肌下缘以远切取双侧坐骨神经，作为同种异体神经的来源。手术显微镜下去除其表面的脂肪组织，并将其分为每段3厘米。首先4℃蒸馏水中静置6h，再将神经段放入3％Triton X-100(聚氧乙烯辛烷基酚)中静置12h，然后置蒸馏水中震荡漂洗6h。如此反复，TritonX-100共作用时间为96h。对萃取的神经段行石蜡切片HE染色及扫描电镜观察去细胞的情况。3.术前抽取实验组18只成年健康的新西兰兔静脉血进白介素2(IL-2)和T淋巴细胞亚群检测。4.种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损的实验观察：将培养的第二代雪旺细胞以1×108/ml的浓度用10μl的微量注射器注入神经段内，然后将神经段迅速移植到兔缺损的一侧坐骨神经(实验组)，对照组移植未注入雪旺细胞的去细胞同种异体神经，术后4周，8周，12周大体观察兔的足部溃疡形成及愈合情况。通过肌电图、光镜、电镜等方法观察运动终板结构形态改变，检测坐骨神经轴突及髓鞘的再生及功能恢复情况，并进行统计学分析。5.术后5日及12日进行兔静脉血IL-2的检测和T淋巴细胞亚群检测并进行统计分析：采用t检验。6.术后观察兔的精神状态，饮食活动，伤口愈合情况。7.组织形态学观察：观察术后5日、12日局部炎性浸润情况。结果：1.兔术后精神状态佳，饮食良好，有跛行，伤口无感染。术后5日与12日取标本HE染色观察有少量炎性细胞浸润，无细胞变性坏死，无神经结构破坏及神经基底膜管塌陷，无移植神经中心性坏死、纤维瘢痕化。2.种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损促进神经-肌结构重建与功能恢复的实验观察：术后4周、8周、16周两组动物。实验组足部溃疡愈合情况、神经纤维数目、髓鞘及再生神经的超微结构，运动终板的形态及靶肌肉结构的恢复均优于对照组。神经传导速度(NCV)于术后4周时，两组均未见明显的神经传导，术后8周、16周实验组优于对照组。3.移植前及移植后5日与12日外周血中白介素-2的浓度无明显变化(P＞0.05)，CD4+和CD8+T淋巴细胞比例无变化(P＞0.05，P＞0.05)，同时CD4+/CD8+值也无升高(P＞0.05)。结论：1.种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体不仅能够能为再生神经提供良好的支架作用，又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生，对坐骨神经缺损后的神经-肌结构重建与功能恢复有更加有效的促进作用。2.种植胎兔雪旺细胞的神经桥接复合体，植入异体后无明显免疫排斥，不引起宿主的全身免疫反应，有很好的组织相容性，故这种植胎儿雪旺细胞重新细胞化的神经桥接复合体将可能成为一种理想的组织工程化人工神经

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 雪旺细胞在组织工程化神经修复作用的研究与进展

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