不同表型的鲍曼不动杆菌对人肺腺癌细胞的黏附及诱导其产生COX-2、IL-8的研究

摘要

目的：鲍曼不动杆菌是呼吸道机会致病菌之一，其致病机理目前尚不完全明了，仅有少数文献[1]报道其对肺腺癌细胞的黏附相关。上皮细胞是抵御病原微生物入侵的第一道防线，致病菌黏附和侵袭上皮细胞引起天然免疫反应在机体防御反应中是启始环节，因此致病菌与宿主上皮细胞的相互关系成为分子细菌学、细胞微生物学研究的重点内容。有研究显示不动杆菌属细菌拥有一种称为粘液产生能力的毒力因子。近年来，临床感染标本中分离出的鲍曼不动杆菌有粘液型和非粘液型两种，本文对两种表型的鲍曼不动杆菌黏附肺腺癌细胞的能力，以及两种表型的鲍曼不动杆菌的活菌菌悬液、培养上清液及菌体裂解液诱导人肺腺癌细胞表达COX-2、IL-8的能力进行研究。目的在于初步探讨鲍曼不动杆菌引起肺癌细胞感染的机理，特别是该菌是否能直接诱导人肺腺癌细胞表达COX-2、IL-8从而引发炎症反应，以及两种表型的鲍曼不动杆菌的黏附能力以及刺激细胞表达COX-2、IL-8的能力是否有差别。 方法： 1.黏附试验：建立细菌数与菌悬液光密度值(OD)的标准曲线，制备2×109cfu/ml、2×108cfu/ml、2×107cfu/ml的活菌菌悬液，培养人肺腺癌细胞A549，取3ml1×105/ml的细胞悬接种于含盖玻片的无菌六孔板，孵育12h后弃培养基加入3ml的各浓度的活菌菌悬液，分别孵育30min、60min、90min，用无菌生理盐水冲洗，吉姆萨染液染色，油镜下计数黏附于50个细胞的细菌数，取均值。 2.活菌菌悬液、培养上清液、菌体裂解液诱导人肺腺癌细胞表达环氧化酶-2(COX-2)、白介素-8(IL-8)：根据标准曲线制备2×109cfu/ml、2×108cfu/ml、2×107cfu/ml的活菌菌悬液；向250ml的LB液体培养基中加入2×109cfu/ml的活菌菌悬液2ml，150r/min振荡培养72h，离心取上清并过滤除菌；将20ml的各浓度的活菌菌悬液在冰浴下超声(频率为5000Hz)30min，过滤除菌；人肺腺癌细胞在25cm2的细胞培养瓶呈单层细胞时，将上述的各浓度的活菌菌悬液和菌体裂解液以及培养上清液4ml加入细胞培养瓶中，孵育6h、12h、24h后提取人肺腺癌细胞的总RNA，进行逆转录扩增(RT-PCR)，将扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。试验结果以均数士标准差表示，数据用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，以p<0.05为有统计学意义。 结果： 1.黏附试验 (1)两种表型的鲍曼不动杆菌活菌菌悬液在2×109cfu/ml、2×108cfu/ml、2×107cfu/ml三个浓度时与人肺腺癌细胞共同孵育30min后黏附数均达到高峰，随着时间的延长黏附的细菌数目逐渐减少，且各组之间具有显著统计学差异。 (2)两种表型的鲍曼不动杆菌活菌菌悬液对人肺腺癌细胞的黏附数在相同的时间点(30min、60min、90min)随着菌悬液浓度的降低而下降，且各组之间具有显著统计学差异。 (3)相同浓度、相同时间点非粘液表型鲍曼不动杆菌的黏附数高于粘液表型，且具有显著统计学差异。 2.人肺腺癌细胞COX-2、IL-8的表达 (1)两种表型鲍曼不动杆菌的活菌菌悬液、培养上清液、菌体裂解液在不同浓度、不同时间点与人肺腺癌细胞孵育后，均只在12h时间点表达COX-2。两种表型的鲍曼不动杆菌活菌菌悬液及培养上清液与肺腺癌细胞孵育后均只在24h时间点表达IL-8；粘液表型的菌体裂解液在2×10Scfu/ml时可以诱导人肺腺癌细胞表达IL-8，而在2×109cfu/ml、2×107cfu/ml时均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8；非粘液表型的菌体裂解液在各浓度则均不能诱导人肺腺癌细胞表达IL-8。 (2)粘液表型的活菌菌悬液诱导肺腺癌细胞表达COX-2、IL-8的能力随着浓度的降低先增强后减弱，在2×10cfu/ml时最强，且具有显著统计学差异；非粘液表型的活菌菌悬液诱导肺腺癌细胞表达COX-2、IL-8的能力随着浓度的降低而增强，且具有显著统计学差异。 (3)两种表型的菌体裂解液诱导细胞表达COX-2的能力随着浓度的降低而增强，且具有显著统计学差异。 (4)除在2×109cfu/ml时，粘液表型菌悬液与非粘液表型表达IL-8无统计学差异外，粘液表型的活菌菌悬液、培养上清液以及菌体裂解液均较非粘液表型的诱导表达COX-2的能力强，表达IL-8能力弱，且具有显著统计学差异。 (5)同一浓度的两种表型的活菌菌悬液均较菌体裂解液诱导肺腺癌细胞表达COX-2能力强，2×10Scfu/ml的粘液表型的活菌菌悬液较菌体裂解液表达IL-8能力强，且具有显著统计学差异。 结论： 1.鲍曼不动杆菌对肺腺癌细胞的黏附数与菌悬液浓度呈正相关，与时间呈负相关。 2.非粘液表型的细菌较粘液表型的细菌对肺腺癌细胞的黏附性强。 3.菌落表型的差异可以影响细菌诱导肺腺癌细胞表达COX-2、IL-8。 4.细菌经过不同的方式处理后诱导细胞表达COX-2、IL-8的能力发生变化。 5.细菌菌体成分及代谢产物，均具有致病作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分鲍曼不动杆菌对肺腺癌细胞的黏附试验

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

第二部分鲍曼不动杆菌菌悬液、培养上清液及菌体裂解液诱导肺腺癌细胞产生COX-2、IL-8的研究

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 细菌感染与细胞因子

致谢

个人简历