RNAi抑制结肠癌细胞系HT-29端粒酶活性的研究

摘要

肿瘤尤其是恶性肿瘤严重危害着人类身体健康。因此，寻找治疗肿瘤的有效方法是目前研究的热点和难点。随着人们生活水平的不断提高，大肠癌的发病率有逐年上升的趋势。临床上主要采用以手术为主、化疗和放疗为辅的综合治疗，但效果并不理想，因此，仍需探索更加有效的新疗法，其中基因治疗被认为是治疗结肠癌最有前景和挑战性的研究方向之一。 研究表明结肠癌的发生、发展、预后与端粒酶异常表达密切相关。端粒酶是由六部分组成的复合体，其中主要部分包括人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriotase，hTERT)和人端粒酶相关蛋白1(telomerase related，protein，TP1)。hTERT在正常组织和细胞中未见表达，但在90％以上的肿瘤组织中呈高表达，且与端粒酶活性高度相关，是端粒酶活性的限速因子。因此，近年来国内外研究者们采用多种策略干扰hTERT基因转录或表达，以期将hTERT基因及其启动子作为肿瘤基因治疗的切入点，达到对恶性肿瘤基因治疗的目的。 RNA干扰(RNA-induced interference,RNAi)是小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA)介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程，即序列特异性的基因沉默。RNAi目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究，有可能为肿瘤基因治疗提供新策略。肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果，但RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰。此外，RNAi识别可以精确到一个核苷酸差异。目前，RNAi在人类功能基因组研究和基因治疗等方面已显示出巨大的前景。目的：设计、构建、筛选靶向hTERT基因的siRNA：观察RNAi对HT-29细胞端粒酶活性的抑制作用；观察对结肠癌细胞恶性增殖和表型的变化；探讨RNAi策略对结肠癌治疗的可行性；同时研究siRNA敲除或抑制目的基因的效力。 方法：通过基因blast比对，设计三条针对hTERT基因的siRNA序列，siRNA的目的序列：I(563-581)：TTGCAAAGCATTGGAATCA；Ⅱ(740-757)：AGAACGTTCCGCAGAGAA；Ⅲ(1 657-1 676)：GTACAGGTTTCACGCATGT。构建干扰质粒I、Ⅱ、Ⅲ及空质粒，并将其分别转染结肠癌细胞系HT-29 48h后，在荧光显微镜下观察质粒转染细胞的效率，运用TRAP-ELISA检测端粒酶活性，通过RT-PCR检测目的基因的敲除效果，应用流式细胞分析技术检测转染后对HT-29细胞周期的影响，运用MTT方法检测HT-29细胞的增殖活性。 结果：1菌落PCR鉴定与测序鉴定结果示：空质粒和I、Ⅱ、Ⅲ三条干扰质粒与设计完全一致。 2质粒转染结肠癌细胞系HT-29 48h后，荧光显微镜下观察各转染组均见大量表达绿色荧光的细胞。 3端粒酶活性的检测：干扰质粒I、Ⅱ、Ⅲ及空质粒转染组细胞与未转染组细胞端粒酶活性结果示：空质粒组与未转染组差异无显著性(P＞0.05)；各干扰I、Ⅱ、Ⅲ组与未转染组、空质粒组差异有显著性(P＜0.05)；干扰Ⅰ组与干扰Ⅱ、Ⅲ组差异均有显著性(P＜0.05)。48h各干扰质粒的抑制率：干扰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组抑制率分别为69％、39％、36％，Ⅰ组抑制率最高。 4 RT-PCR结果示空质粒组与未转染hTERT/β-actin的IOD比值相比差异无显著性(P＞0.05)，干扰I组hTERT/β-actin的IOD比值与空质粒组、未转染组差异均有显著性(P＜0.05)，且降低为空质粒组的52.5％。 5 MTT结果：空质粒组与未转染组OD值相比差异无显著性(P＞0.05)，干扰Ⅰ组OD值较空质粒组、未转染组差异均有显著性(P＜0.05)，且对细胞生长的抑制率为24.36％。 6 流式细胞仪分析结果显示空质粒组与未转染组相似，均以S期细胞为主，G2/M期细胞、G0/G1期细胞变化不明显，细胞凋亡率差异无显著性(P＞0.05)。而干扰I组与空质粒组、未转染组比较，S期细胞明显减少，G0/G1期细胞显著增加，细胞凋亡率差异有显著性(P＜0.05)，且显著增加。 结论：①针对hTERT基因不同位点所设计的siRNA的诱导RNAi的作用效力是不同的；②利用RNAi-DNA载体技术抑制hTERT基因的方法切实可行；③利用RNAi技术敲除或下调hTERT基因进行恶性肿瘤治疗具有可行性；④RNAi抑制结肠癌的HT-29细胞恶性增殖的可能机制是在转录或转录后水平下调端粒酶活性，阻止细胞增殖，并促进细胞凋亡。

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述RNAi及其在结直肠癌基因治疗中的应用

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