丁苯酞对血管性痴呆小鼠海马神经元谷氨酸受体及钙信号转导机制的作用研究

摘要

目的：血管性痴呆(vascular dementia，VD)由于各种脑血管病引起的获得性认知功能障碍，以学习、记忆功能缺损为主要症状，可伴有语言、运动、视空间及人格障碍等。 本文通过探讨谷氨酸受体及钙信号转导机制，观察丁苯酞治疗VD的效果并探讨其作用机制。 方法： 1.采用三次双侧颈总动脉结扎，造成脑组织反复缺血/再灌注，建立了小鼠VD模型，建立假手术组排除手术本身对小鼠所致的影响，通过跳台试验和水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试，观察其行为学改变；用HE染色观察海马病理学特征变化。 2.采用免疫组化和反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定各组小鼠海马谷氨酸AMPA-GluR2蛋白及GluR2 mRNA的变化。 3.采用免疫组化和RT-PCR方法测定各组小鼠海马谷氨酸NMDA-NR2B蛋白及NR2B mRNA的变化。4 采用流式细胞分析技术测定各组小鼠海马细胞[Ca2+]i变化；Western-Blot及RT-PCR方法检测CaMPKⅡ蛋白及mRNA表达的变化。5 Western-Blot及RT-PCR方法检测CREB蛋白及mRNA表达的变化。 结果： 1.VD小鼠模型的行为学评价及海马病理学特征 3月龄雄性昆明小鼠196只，分为假手术对照组、VD模型组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组。采用双侧颈总动脉结扎，连续三次脑缺血(20 min)再灌注(10min)，建立VD小鼠模型。术后29d，各组分别进行跳台试验及水迷宫实验，测试学习成绩；术后30d测试记忆成绩，HE染色观察各组小鼠海马组织病理学特征。 1.1 学习成绩术 后第29天，分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试跳台试验反应时间(sec)和错误次数(number/5 min)作为学习成绩，水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number/3 min)作为学习成绩。 跳台试验结果显示：(1) 与假手术对照组的反应时间(48.76±9.24)s比较，VD模型组小鼠学习阶段的反应时间(89.41±12.08)s明显延长(P<0.01)；(2) 与VD模型组的反应时间比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的反应时间(59.68±10.27)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的反应时间(57.23±10.05)s均明显缩短(P<0.01)；(3) 与假手术对照组的错误次数(1.23±0.27)比较，VD模型组小鼠学习阶段的错误次数(3.74±0.42)明显增加(P<0.01)；(4) 与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(1.52±0.38)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的错误次数(1.48±0.31)均明显减少(P<0.01)；(5) 假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组之间的学习成绩无显著性差异(P>0.05)。 水迷宫试验结果显示：(1) 与假手术对照组的游全程时间(87.32±13.46)s比较，VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间(145.80±13.29)s明显延长(P<0.01)；(2) 与VD模型组的游全程时间比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(101.89±18.38)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(99.18±11.25)s明显缩短(P<0.01)；(3) 与假手术对照组的错误次数(16.88±4.19)比较，模型组小鼠学习阶段的错误次数(34.60±5.92)明显增多(P<0.01)；(4) 与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(18.71±4.35)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数(17.29±4.82)明显减少(P<0.01)；(5) 假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组的学习成绩之间无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示VD模型小鼠的学习成绩降低，丁苯酞可以改善其学习成绩。 1.2 记忆成绩 术后第30天，分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试跳台试验潜伏时间(sec)和错误次数(number/5min)作为记忆成绩，水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number/3 min)作为记忆成绩。 跳台试验结果显示：(1) 与假手术对照组的潜伏时间(148.92±20.83)s比较，VD模型组小鼠记忆阶段的潜伏时间(78.67±19.17)s明显缩短(P<0.01)；(2) 与VD模型组的潜伏时间比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的潜伏时间(131.41±18.82)s及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的潜伏时间(128.57±18.29)s均明显延长(P<0.01)；(3) 与假手术对照组的错误次数(0.32±0.05)比较，VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数(1.72±0.13)明显增加(P<0.01)；(4) 与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(0.54±0.08)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的错误次数(0.50±0.07)均明显减少(P<0.01)；(5) 假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组之间的记忆成绩无显著性差异(P>0.05)。结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低，丁苯酞可以改善其记忆成绩。 水迷宫试验结果显示：(1) 与假手术对照组的游全程时间(67.82±8.79)比较，VD模型组小鼠记忆阶段的游全程时间(137.40±11.86)明显延长(P<0.01)；(2) 与VD模型组的游全程时间比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(88.73±9.53)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(83.87±8.62)明显缩短(P<0.01)；(3) 与假手术对照组的错误次数(9.57±2.91)比较，模型组小鼠记忆阶段的错误次数(20.90±4.25)明显增多(P<0.01)；(4)与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(11.17±3.04)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(10.27±2.83)明显减少(P<0.01)；(5) 假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组的记忆成绩之间无显著性差异(P>0.05)。 以上结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低，丁苯酞可以改善其记忆成绩。 1.3 VD小鼠海马病理学改变 在光镜下，(1) 假手术对照组小鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆，核仁明显，细胞排列较致密整齐。(2) 相比之下，VD模型组小鼠海马CA1区锥体细胞松散，层次不清，有细胞缺失现象；炎性细胞浸润；部分细胞旁有空染区，核固缩、胞质浓染、胞体变小，并且有胶质细胞增生形成结节。(3) 丁苯酞治疗组和预防治疗组小鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐，未发现炎性细胞浸润，核固缩现象较少见。 2.VD小鼠海马CA1区AMPA-GluR2受体表达水平及丁苯酞的影响 2.1 AMPA-GluR2免疫组化染色 2.2 AMPA-GluR2 mRNA RT-PCR检测 3.VD小鼠海马CA1区NMDA-NR2B受体表达水平及丁苯酞的影响 免疫组化观察NMDA-NR2B受体的变化，RT-PCR观察NMDA-NR2BmRNA表达的变化。方法同2。 3.1 NMDA-NR2B受体免疫组化染色 3.2 NMDA受体mRNA RT-PCR检测 4 VD小鼠海马神经元钙信号转导机制及丁苯酞的影响 4.1 VD小鼠海马神经元静息态[Ca2+]i的变化及丁苯酞的影响 4.2 VD小鼠海马神经元CaMPK Ⅱ表达水平的变化特征及丁苯酞的影响 4.3 VD小鼠海马神经元CaMPKⅡ mRNA RT-PCR结果 5 VD小鼠海马神经元CREB水平变化及丁苯酞的影响 5.1 VD小鼠海马神经元CREB表达水平的变化特征及丁苯酞的影响 5.2 VD小鼠海马神经元CREB mRNA RT-PCR结果 结论： (1) 本实验建立的VD小鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍，是研究VD比较理想的动物模型，对深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海马CA1区出现病理性变化。 (2) VD小鼠海AMPA-GluR2蛋白和mRNA表达水平降低，与其学习和记忆成绩下降相一致，提示GluR2表达水平降低可能参与了VD的发病。 (3) VD小鼠海马NMDA-NR2B蛋白和mRNA表达水平降低，与其学习和记忆成绩下降相一致，提示NMDA-NR2B表达水平降低可能参与了VD的发病。 (4) VD小鼠海马细胞静息态[Ca2+]i升高，CaMPKⅡ蛋白表达及CaMPKⅡ mRNA水平降低，导致钙信号转导系统功能紊乱，可能参与了VD的分子生物学发病机制。 (5) VD小鼠海马神经元CREB蛋白及mRNA表达水平降低，与其学习和记忆成绩下降相一致，提示CREB蛋白表达水平降低可能参与了VD的分子生物学发病机制。 丁苯酞在改善VD小鼠学习和记忆成绩的同时，可显著减轻VD小鼠海马细胞内[Ca2+]i、CaMPKⅡ、NR2B、GluR2和CREB水平等方面的异常，从而发挥对VD的治疗作用，并且改善了海马组织CA1区病变，此与其学习和记忆成绩改善相一致。提示此药可能具有改善VD的药理学作用。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分血管性痴呆小鼠模型的建立、海马病理学的变化及丁苯酞的治疗作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分血管性痴呆小鼠海马CA1区神经元AMPA-GluR2受体及其mRNA表达水平变化及丁苯酞的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分血管性痴呆小鼠海马CA1区神经元NMDA-NR2B受体及其mRNA表达水平变化及丁苯酞的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分血管性痴呆小鼠海马神经元钙信号转导机制的变化及丁苯酞的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分血管性痴呆小鼠海马神经元CREB水平的变化及丁苯酞的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 谷氨酸受体与突触可塑性及缺血性脑损伤关系研究进展

致谢

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