IL-8基因真核表达载体的构建及其对OVCAR-3细胞生物学机制的研究

摘要

目的：卵巢癌是威胁妇女健康常见的妇科肿瘤，因其早期发现较难，肿瘤类型多，组织结构复杂并各具不同的生物学特性，一直是妇科肿瘤领域研究的热点。上皮性癌其恶性程度比间质性肿瘤高，治疗效果远不如生殖细胞癌，此种肿瘤发展迅速，不易早期诊断，死亡率高，是该领域中最有待研究的一种肿瘤，因此一种新的治疗方法亟待需要。基因的异常表达及其与卵巢肿瘤的发生发展关系的研究己成为分子生物学研究的热点。卵巢癌的发生和发展是一个复杂、多步骤的过程，与许多基因和蛋白的表达密切相关。 白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)，是Yoshimur于1987年发现的第一个趋化性细胞因子，属于CXC家族，在炎症和免疫过程中起重要的调节作用。近来作为恶性肿瘤相关分子越来越多地引起了研究者的关注。目前已知多种肿瘤细胞均可分泌IL-8，实体肿瘤组织IL-8过表达与肿瘤生长侵袭转移密切相关，而其促进肿瘤发生发展的机制尚不完全清楚。 近年重组技术的建立与发展在理论和实践上为卵巢癌治疗提供了新的策略——基因治疗有望成为卵巢癌治疗的新途径。理想的治疗基因应有效的抑制肿瘤细胞生长，而对正常组织、细胞无明显抑制作用。本研究将人IL-8基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，在脂质体作用下瞬时转染低表达IL-8基因的上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3中，探讨该基因诱导的上皮性卵巢癌细胞功能的改变及其生物学机制，为进一步研究IL-8基因治疗上皮性卵巢癌的提供了可行性。 方法： 1构建IL-8基因真核表达载体　提取健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA，通过RT-PCR扩增IL-8编码序列基因片段，并将其克隆至PMD-18T载体构成PMD-18T/IL-8，BamHI和XhoI双酶切后，与经相同双酶切后的真核pCDNA3.1(+)表达载体连接，构建成pcDNA3.1(+)/IL-8重组质粒。 2瞬时转染人卵巢癌细胞OVCAR-3 以脂质体介导法将pcDNA3.1(+)/IL-8重组质粒转染低表达该目的基因的OVCAR-3细胞，经RT-PCR、ELISA、Westem-blot法检测转染细胞中IL-8的表达情况。 3检测细胞增殖情况MTT法检测转染pcDNA3.1(+)/IL-8组与未转染组细胞的生长增殖能力，绘制生长增殖曲线。 4检测各组细胞的细胞周期变化用流式细胞仪(FCM)检测3组细胞，即转染pcDNA3.1(+)/IL-8重组质粒组、转染pcDNA3.1(+)空载体组和未转染组OVCAR-3细胞周期变化。 5测定各组细胞的Bax、Bcl-2、VEGF和MMP-9四种蛋白的表达情况采用FCM检测转染pcDNA3.1(+)/IL-8重组质粒组、转染pcDNA3.1(+)空载体组和未转染组3组细胞的Bax、Bcl-2、VEGF和MMP-9四种蛋白的表达变化。 结果： 1经PCR扩增、双酶切及DNA测序鉴定，证实pcDNA3.1(+)/IL-8构建成功。 2.RT-PCR法检测到瞬时转染的OVCAR-3细胞中有大量IL-8的表达，转染pcDNA3.1(+)/IL-8后IL-8基因的扩增片段灰度值为226.88±5.47，与相应β-actin灰度值之比1.55；未转染组的IL-8基因相应位置的灰度值120.38±6.72，与相应β-actin灰度值之比0.82，增殖率为189.02‰ELISA法检测结果，转染pcDNA3.1(+)/IL-8质粒6h、48h后细胞上清和细胞裂解液中IL-8表达量分别为3.694-0.37、19.67±0.24、11.10±1.14，而未转染组和转空载体粒组仅检测到极少量，后两者与前者比较有统计学意义(P＜0.05)；Western-blot法检测前者有IL-8特异性蛋白条带(8KD)，后两者未见特异性条带。 3.MTT法结果显示，转染pcDNA3.1(+)/IL-8后第1～6天光吸收值分别为：0.56±0.08、0.63±0.06、 0.93±0.09、1.20±0.06、1.32±0.12、1.39±0.14；未转染组第1～6天为：0.62±0.07、0.70±0.10、0.84±0.12、0.92±0.10、0.96±0.14、1.01±0.10，第1～3天两两比较均无统计学意义(P＞0.05)，转染3天后，两种细胞的光吸收值在统计学上具有显著差异(P＜0.05)，且细胞的增殖率随着时间的延长呈现上升趋势。 4 流式细胞周期结果表明转染pcDNA3.1(+)/IL-8与转染pcDNA3.1(+)、未转染组三组细胞进入S期数分别为：55.18±2.98、39.72±4.16、31.36±1.46，前者进入S期数明显增多，且与后两者比较有统计学意义(P＜0.05)；三者增殖指数分别为：58.83±2.85、44.32±4.20、35.31±1.56，转染pcDNA3.1(+)/IL-8组PI值明显增加，且与后两者比较具有统计学意义(P＜0.05)。 5 FCM检测转染pcDNA3.1(+)/IL-8、转染pcDNA3.1(+)和未转染三组细胞蛋白结果表明，与细胞增殖相关细胞因子VEGF和MMP-9表达量分别为：430.44±21.70、358.70±17.77、335.52±19.68；356.15±22.70、279.37±27.48、283.56±26.67，转染pcDNA3.1(+)/IL-8组与后两者比较有统计学意义(p＜0.05)；三组凋亡抑制因子Bcl-2结果分别为380.86±15.27、319.15±17.89、305.04±28.90；凋亡因子Bax分别为343.12±26.10、416.27±25.45、420.13±23.65，前者与后两者比较有统计学意义(p＜0.05)，而未转染组与转染空质粒组比较均无统计学意义(p＞0.05)。 结论：目的基因IL-8可以在脂质体介导下有效的转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3，其通过提高进入细胞S期数明显促进卵巢癌细胞的生长，且其机制与促血管生成因子和凋亡相关因子密切相关，这为进一步研究IL-8在卵巢肿瘤中的作用机制提供了基础。

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论文说明：英文缩写

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摘要

引言

第一部分人IL-8基因真核表达载体的构建

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分IL-8对卵巢癌OVCAR-3细胞增殖和抑制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 白细胞介素8与肿瘤的发生发展及转移的关系

致谢

个人简历