托吡酯对成年癫痫大鼠海马齿状回神经发生影响的研究

摘要

目的：近年来研究发现，成年哺乳动物脑内存在神经发生，其中海马齿状回颗粒细胞下层是两个主要区域之一。神经发生指神经细胞的再生，包括神经前体细胞增殖、存活、分化及新生神经元的迁移等过程。许多损伤因素诸如外伤、缺血缺氧、癫痫等均可导致成年海马神经发生。本研究利用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品建立成年大鼠SE模型，通过5-溴脱氧尿核苷（BrdU）标记新生的神经细胞，利用免疫组织化学、免疫荧光等方法观察托吡酯影响癫痫后海马齿状回神经发生的情况，利用Fluoro-Jade B法观察托吡酯是否对神经元有保护作用，为进一步探讨新生神经元的功能提供依据。
　　 方法：取购自第四军医大学实验动物中心的32只Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠，出生8w，体重200-220g。（30mg/kg），当大鼠痫性发作达Ⅳ级并持续达90min时给予腹腔注射苯巴比妥钠（50mg/kg）终止发作，解除痫性发作后状态良好的视为合格SE模型。正常大鼠以相同体积的0.9％氯化钠取代氯化锂、匹罗卡品和苯巴比妥钠。随机取16只正常及16只SE大鼠分为注射BrdU后1d组及28d组，各组动物再次随机做标记，分为4小组（正常对照组，SE对照组，正常+托吡酯组， SE+托吡酯组），每小组4只大鼠。在制备SE模型后5h时开始进行干预：正常+托吡酯组和SE+托吡酯组给予溶于蒸馏水的托吡酯（80mg/kg.d，分2次）灌胃，正常对照组和SE对照组给予蒸馏水（与托吡酯同体积）灌胃。于干预后第6d腹腔注射BrdU标记海马齿状回新生的神经细胞，分别于注射BrdU后1d、28d对相应组别大鼠给以戊巴比妥钠（50mg/kg）过量麻醉后，取脑，冰冻切片机切片，每隔5张取一张海马组织为1组脑片收集于0.01M磷酸钾盐缓冲生理盐水（potassium phosphate-buffered saline，KPBS）中备用。用免疫组织化学方法通过观察各组大鼠注射。BrdU后第1d及第28d海马齿状回BrdU阳性细胞的表达了解新生细胞的增殖及存活情况；用免疫荧光双标方法通过观察各组大鼠注射BrdU后第28d BrdU/神经元核性蛋白（NeuN）、BrdU/胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达了解新生细胞分化情况；用免疫组织化学方法通过观察各组大鼠注射BrdU后第28ddoublecortin（DCX）阳性细胞的表达了解新生神经元迁移情况；用Fluoro-Jade B染色法观察各组大鼠注射BrdU后第28d海马齿状回神经元的变性。所得数据应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及Tukey组间比较。
　　 结果：⑴注射BrdU后1d，SE对照组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数量与正常对照组比较明显增加（P<0.01）；SE+托吡酯组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞与SE对照组比较明显减少（P<0.01）。⑵射BrdU后28d，SE对照组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数量与正常对照组比较明显增加（P<0.01）；SE+托吡酯组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数量与SE对照组比较明显增加（P<0.01）。⑶注射BrdU后28d，SE对照组大鼠海马齿状回BrdU/NeuN双阳性细胞数量与正常对照组比较明显增加（P<0.01）；SE+托吡酯组大鼠海马齿状回BrdU/NeuN双阳性细胞数量与SE对照组大鼠比较明显增加（P<0.01）；但各组BrdU阳性细胞分化为NeuN阳性细胞的比例无明显差异（P>0.05）。⑷注射BrdU后28d，SE对照组大鼠海马颗粒细胞层DCX阳性细胞数目与正常对照组比较明显减少（P<0.01），伸向门区的突起数目有所增加；SE+托吡酯组大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数目与SE对照组比较无明显差异（P>0.05），伸向门区的突起数目亦无明显差异。⑸注射BrdU后28d，SE对照组大鼠海马齿状回Fluoro-JadeB阳性细胞数量与正常对照组比较明显增加（P<0.01）；SE托吡酯组大鼠海马齿状回Fluoro-Jade B阳性细胞数量与SE对照组大鼠比较明显减少（P<0.01）。
　　 结论：①癫痫可促进海马齿状回内源性神经前体细胞的增殖，但其对新生细胞的存活有抑制作用。②癫痫后新生的细胞大部分分化为成熟神经元，且新生神经元发生了异位迁移。③托吡酯对癫痫后海马齿状回内源性神经前体细胞的增殖有抑制作用，但其对新生神经细胞的存活有促进作用。④托吡酯对癫痫后海马齿状回新生神经细胞分化为成熟神经元无明显促进作用，对新生神经元的异位迁移无抑制作用。⑤长时间托吡酯治疗对癫痫后海马齿状回神经元有保护作用。

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结论

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综述 癫痫后海马齿状回神经发生的研究进展

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