犬传染性肝炎核酸疫苗对Beagle犬的细胞免疫效果及免疫机制研究

摘要

目的：
　　 犬传染性肝炎（Infectious canine hepatitis，ICH）是由犬传染性肝炎病毒（ICHV）又称Ⅰ型犬腺病毒引起的一种常见的急性败血性传染病。本病广泛分布于世界各地，犬不分品种、年龄和性别，可以全年发生，但以离乳至一岁以内的幼犬的感染率和死亡率最高，对养犬业和实验犬的饲养均可造成极大的危害。
　　 目前主要通过接种灭活疫苗和减毒活疫苗预防ICH的发生。在疫苗制备过程中病毒的逃逸以及灭活不完全均可造成该病的暴发。紧急预防或治疗已发病的病犬可使用同型或异型免疫血清或丙种球蛋白，但对犬的保护效果有限。
　　 核酸疫苗是90年代从基因治疗研究领域发展起来的一项新的生物技术，是将作为免疫原的一种或多种蛋白编码基因克隆到真核表达载体（质粒）上，将构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统，因此也有人称其为基因疫苗。它的研究具有深远意义，可用于对细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。
　　 本研究室的前期研究工作，用已构建的犬传染性肝炎核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop，免疫BALB/c小鼠后，诱导出了特异性体液免疫和细胞免疫，产生具有杀伤表达病毒抗原靶细胞的CTL效应，显示出良好的免疫原性和免疫反应性。
　　 为进一步验证pVAX1-CpG-Loop对本动物犬的免疫效果，寻求最佳的免疫剂量和免疫策略，本研究采用已构建的犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬，进行攻毒试验，对其免疫效果及免疫机制进行研究。
　　 方法：
　　 1、用碱裂解法大量提取真核重组质粒
　　 将重组质粒阳性克隆菌接种于2×YT液体培养基振荡培养36h；离心收集菌体。采用SDS-碱裂解法大量提取重组质粒，并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop进行纯度和浓度测定。
　　 2、重组Loop蛋白的提取
　　 将原核表达质粒pET28a（+）Loop转化大肠杆菌BL21（DE3），摇菌并诱导重组Loop蛋白的表达。采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，透析并复性后浓缩目的蛋白。
　　 3、重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫Beagle犬
　　 6只已接种两联苗Beagle犬随机编为1-6号。1号，2号，3号犬：分别经双侧股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg，600μg，800μg/只/次，最后一次与相同剂量的重组Loop蛋白共免疫；4号，5号，6号犬：分别经双侧股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg，600μg，800μg/只/次，7号犬：已接种六联苗。
　　 以上1-6号犬于免疫前15min均经股四头肌注射25％灭菌蔗糖每侧500μl。分别于0、8、16周免疫，末次免疫后6周，进行攻毒实验。（1号犬称为pp400，第一个p代表重组质粒plasmid，第二个p代表重组蛋白protein，400代表400μg；依此类推，2～6号犬分别为pp600，pp800，p400，p600，p800；7号犬为control。）
　　 4、免疫效果评价
　　 4.1 T淋巴细胞增殖实验采用MTT法检测免疫犬的外周血T淋巴细胞增殖活性。
　　 4.2蛋白特异性CTL活性分析采用Cyto Tox96非放射性细胞毒性检测试剂盒进行检测。
　　 4.3淋巴细胞诱生因子的检测取5×106/ml的犬外周血淋巴细胞培养上清，采用犬IFN-γ与犬IL-4定量试剂盒测定标本中IFN-Y与IL-4的浓度。
　　 4.4 IFN-γ酶联免疫斑点检测采用犬IFN-γ ELISpot试剂盒检测分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数。
　　 4.5 RT-PCR检测细胞因子mRNA的表达采用RT-PCR检测细胞因子IFN-γ和细胞因子IL-4的表达。
　　 结果：
　　 1、用碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1-CpG-Loop，用分光光度计进行纯度和浓度测定，OD260/OD280在1.8-2.0之间。诱导表达的重组Loop蛋白经镍离子亲和层析纯化，在GuNTA-200咪唑洗脱液中含量最高。
　　 2、在末次免疫后两周，重组质粒免疫犬外周血淋巴细胞在体外分别经ConA和重组Loop蛋白刺激后增殖活性高于对照犬。病毒攻击后两周，经ConA刺激后，p800免疫犬增殖活性超过攻毒前，明显高于其他免疫犬。
　　 3、在末次免疫后两周，重组质粒免疫犬CTL杀伤活性均高于对照犬；在病毒攻击后两周，pp600及p400免疫犬CTL杀伤活性高于对照犬。
　　 4、末次免疫后两周，重组质粒免疫犬外周血淋巴细胞分别经ConA和重组Loop蛋白体外刺激后培养上清中的细胞因子IL-4浓度高于对照犬；攻毒后两周，单用质粒免疫犬IL-4浓度稍高于对照犬。末次免疫后六周，重组质粒免疫犬外周血淋巴细胞培养上清中IFN-γ浓度高于对照犬，攻毒后两周，p400及p600免疫犬外周血淋巴细胞培养上清中的IFN-γ浓度升高并高于对照犬。
　　 5、末次免疫后六周，p400免疫犬外周血淋巴细胞中分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞数明显高于对照犬。
　　 6、RT-PCR检测细胞因子的表达显示，末次免疫后两周及攻毒后两周重组质粒免疫犬细胞因子IL-4的表达量均高于对照犬；末次免疫后两周，重组质粒免疫犬有细胞因子IFN-γ的表达，对照犬无表达；攻毒后两周，pp800共免疫犬细胞因子IFN-γ的表达最高。
　　 结论：
　　 1、综合实验结果，在重组质粒免疫犬能检测到外周血淋巴细胞增殖活性及CTL杀伤活性，也可检测到能分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞，提示重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫犬后能诱导出特异性细胞免疫应答。
　　 2、重组质粒免疫犬外周血淋巴细胞培养上清中的细胞因子IL-4的浓度及IL-4在mRNA水平的相对表达量均达到对照犬水平，表明重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫犬后能诱导出体液免疫应答。
　　 3、质粒与蛋白共免疫与单用质粒免疫犬的免疫效果无明显差别。单用重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫Beagle犬即可得到较好的细胞免疫效果。

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结论

参考文献

综述 犬传染性肝炎病毒与疫苗

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