犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫效果研究

摘要

目的：犬传染性肝炎（Infectious canine hepatitis ICH）是由犬传染性肝炎病毒（ICHV）引起的一种常见的急性败血性传染病，传染性强，无明显季节性，各种品系，不同年龄的犬均可被感染，尤其以六周龄至一岁以内的犬发病率高，死亡率达10～40％，对养犬业和实验犬的饲养均可造成极大的危害。预防本病发生的主要措施就是加强饲养管理，严格兽医卫生措施和定期免疫接种。目前，在实验用犬和其他养犬业，主要采取定期接种ICtⅣ弱毒疫苗的方法。
　　 核酸疫苗是近年发展起来的一项新的免疫技术，与传统疫苗相比有诸多优点，被称为第三代疫苗。核酸疫苗免疫接种后，可在动物体内诱导体液免疫应答，对动物产生免疫保护作用。抗体是由抗原刺激B细胞经分化和增殖后产生的免疫球蛋白，因此在机体接受免疫接种以后，检测机体的抗体水平，成为评价机体免疫反应及疫苗免疫效果的一个重要体液免疫指标。中和抗体是病原微生物侵袭机体后，所产生的具有中和相应病原微生物及其毒性产物（毒素），使病原微生物丧失感染能力或毒力的抗体，是进行病毒感染机制研究的重要工具。中和抗体水平的监测是反映疫苗免疫原性的一个重要体液免疫指标。
　　 核酸疫苗作为一种新兴的疫苗，大量实验表明在感染性疾病、肿瘤等的预防和治疗方面具有很大的潜力。本研究室采用基因重组技术构建了含有Loop1、Loop2的重组质粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后，诱导小鼠产生针对抗原的特异性IgG抗体和抑制病毒感染的中和抗体。为确定此核酸疫苗对犬的免疫应答效果，本研究采用pVAX1-CpG-Loop对Beagle犬进行免疫，对其体液免疫应答效果进行评价。旨在探索pVAX1-CpG-Loop作为预防犬传染性肝炎核酸疫苗的有效性，为犬传染性肝炎病毒核酸疫苗的开发研究奠定基础。
　　 方法：
　　 1、质粒的提取及抗原蛋白的诱导表达和纯化
　　 采用SDS-碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1-CpG-Loop，采用聚乙二醇沉淀法纯化质粒。并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度和浓度测定。将原核表达质粒pET28a（+）Loop转化大肠杆菌BL21（DE3），摇菌并诱导重组Loop蛋白的表达。用尿素溶解沉淀，采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，透析、复性后浓缩目的蛋白。
　　 2、实验动物的分组及免疫
　　 6只Beagle犬进行随机编号：1号、2号、3号犬：分别于0、8、16周注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次，最后一次与相同剂量的抗原蛋白共免疫；4号、5号、6号犬：分别于0、8、16周仅注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次，每只动物均于免疫前经双侧股四头肌注射25％灭菌蔗糖1ml/只，15min后于相同部位进行质粒免疫，抗原蛋白免疫于颈部皮下。7号犬：为已接种传统疫苗对照。
　　 3、攻毒试验
　　 在第3次接种6周后，对实验犬进行攻毒试验。取病毒株经MDCK细胞增殖，取MDCK细胞培养物（TCID50为10-4.23/0.1ml），在麻醉状态下，通过口腔粘膜感染病毒，剂量为1 ml/只。
　　 4、免疫动物的体液免疫效果评价
　　 间接ELISA法检测免疫犬特异性IgG抗体，以包被液稀释的犬传染性肝炎病毒（1：5稀释病毒），100μl/孔包被酶联板，4℃过夜；去除包被液，以PBST洗涤3次，20％胎牛血清-PBST封闭，37℃于湿盒中放置1h；然后加入待检的不同稀释度的犬血清100μl/孔，37℃于湿盒中放置1h，洗涤3次；加入HRP标记的兔抗狗IgG抗体（1：2000），37℃于湿盒中放置1h，沈涤3次；加入显色底物OPD溶液1001μl/孔，避光显色；加入50μl/孔2mol/L H2SO4终止反应。酶标分析仪检测492nm波长下的OD值（OD492）。以P/N大于1.8为阳性。
　　 间接免疫荧光试验（IFA）测定血清抗体效价，免疫后静脉采血，分离血清，将待测血清置56℃灭活30min，血清样品用PBS稀释为1：10、1：50、1：100、1：200、1：400、1：8006个稀释度，滴加于抗原片上，设PBS为空白阴性对照。在37℃温箱中孵育30min；PBS振荡洗涤3次，每次5 min；加1：200稀释度的羊抗犬IgG FITC标记物，在37℃温箱中孵育30min；PBS振荡洗涤3次，每次5min；加1：2000稀释度的伊文思蓝，在37℃温箱中染色30min；PBS振荡洗涤3次，每次5min；最后用蒸馏水冲洗，室温吹干；用90％缓冲甘油液封片，在荧光显微镜下观察。
　　 中和试验测定血清中和抗体效价：收集各犬的血清，灭活后采用固定病毒.稀释血清法进行中和实验。用DMEM将血清样品做连续倍比稀释。分别在上述血清中加入等量的适当滴度的病毒（100TCID50），充分混匀后置于37℃孵育1h；接种至敏感细胞（MDCK），100μl/孔，设两复孔，并设置正常细胞对照；37℃，5％CO2培养箱中孵育1h：弃去血清-病毒混合液，用Hanks液洗涤细胞3次，加入细胞维持液，37℃培养3天观察细胞病变。
　　 结果：
　　 1、重组质粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取
　　 用碱裂解法大量提取所得的真核重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度和浓度测定，OD260/OD280分别为1.82、1.9、1.88。
　　 2、Loop蛋白的诱导、表达和纯化
　　 pET28aLoop重组质粒转化宿主菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，做SDS-PAGE电泳，诱导表达菌在36kDa处出现一条蛋白表达条带，对照组无此条带。用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白，SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白纯度在95％至98％之间。
　　 3、间接ELISA测定免疫犬血清IgG水平
　　 攻毒前各实验犬产生的特异性抗体无显著变化，其中1号犬及7号犬所产生的抗体效价明显高于其它犬。攻毒后各实验犬所产生的抗体效价均明显增高，7号犬在第一周达到最高值，其它实验犬在第三周达到最高值，后逐渐下降持续至27周。
　　 4、间接免疫荧光试验（IFA）测定免疫犬血清总IgG抗体水平
　　 攻毒前1号、4号、5号和7号实验犬检测到IgG抗体滴度持续为1：10，其余实验犬未检测到特异性抗体。攻毒后，在第五天抗体水平开始升高，其中1号、5号和7号犬达1：50，4号犬仍为1：10，2号、3号和6号犬未检测到IgG抗体。从第一周开始各试验犬抗体水平开始显著升高，1号犬和4号犬在三周达最高滴度为1：400，其它各犬在第一周达最高滴度为1：200。各犬抗体逐渐下降持续至第7周，于第14周检测不到抗体。
　　 5、中和试验测定免疫犬血清中和抗体水平
　　 攻毒前，除7号犬（中和抗体效价为1：8）其余各实验犬均未检测到中和抗体。在攻毒后，所有实验犬自第5天开始检测到中和抗体，1号犬较其它各实验犬抗体滴度高为1：128；1号、4号、5号和7号犬在第一周达最高滴度1：1024，其它各犬在第三周达其最高滴度，至第五周显著下降后逐渐下降至第27周。
　　 结论：
　　 1、本室构建的犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能够诱发Beagle犬产生较好的体液免疫应答反应。
　　 2、本室构建的犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop能够诱发Beagle犬产生中和抗体。

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结论

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综述 增强核酸疫苗在大动物中免疫效果

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