胰岛素抵抗与2型糖尿病大鼠心肌脂肪酸代谢相关基因转录水平的改变

摘要

目的：心肌以脂肪酸和糖为主要能源物质，胰岛素抵抗和2型糖尿病时，糖利用障碍，血中游离脂肪酸增加，进入心肌的脂肪酸增多，心肌几乎完全依赖脂肪酸的β氧化供能。那么脂肪酸β氧化相关基因的表达会发生什么样的改变?2型糖尿病时，可观察到心肌甘油三酯沉积，这是否与合成甘油三酯的限速酶表达增加有关?单纯胰岛素抵抗时是否也出现相似改变?鉴于此，本实验拟观察心肌中催化脂肪酸氧化和脂肪酸合成甘油三酯的相关酶基因的转录水平变化，探讨胰岛素抵抗和2型糖尿病时心肌脂肪酸代谢异常的分子机制。为研究脂肪酸代谢异常在糖尿病心肌病变发生发展中所起的作用提供实验依据。
　　 脂肪酸进入心肌后，在线粒体和过氧化物酶体中进行氧化分解。线粒体β氧化途径的关键酶是肌型-肉毒碱脂酰转移酶1（muscle-carnitine palmitoyltransferase1，m-CPT1）；过氧化物酶体主要氧化分解极长链的直链和支链脂肪酸。过氧化物酶体β氧化途径中，催化脱氢反应的酶有：脂酰辅酶A氧化酶1和脂酰辅酶A氧化酶3（acyl-CoA oxidase，ACOX1， ACOX3）；催化加水-再脱氢反应的酶有：-L-双功能蛋白（L-bifunctional protein，LBP）和D-双功能蛋白（D-bifunctional protein，DBP）；催化硫解反应的酶有：3-酮酯酰辅酶硫解酶A和B（3-Ketoacyl-CoA thiolaseA/B，THLA/B），以及固醇载体蛋白x（sterol carrier protein x，SCPx）。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα）在心脏能量底物的选择性改变中起关键作用，激活的PPARα可促进上述β氧化途径中部分酶基因的表达，提高脂肪酸β氧化水平。胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下，心肌脂肪酸β氧化的增高是否与上述相关分子基因表达的增高有关?
　　 二酰基甘油酰基转移酶1（diacylglycerol transferase1，DGAT1）和二酰基甘油酰基转移酶2（diacylglycerol transferase2，DGAT2）是心肌甘油三酯合成的关键酶，可催化脂肪酸酯化生成甘油三酯。正常情况下，心肌极少合成和储存甘油三酯，但胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下，心肌细胞内却有脂肪的沉积，这是否与心肌DGAT1和DGAT2的表达增强有关?
　　 基于上述目的，本实验采用高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗；在胰岛素抵抗基础上小剂量腹腔注射STZ，诱导2型糖尿病。观察模型大鼠心肌中涉及脂肪酸氧化的PPARα、M-CPT1、ACOX1、LBP、THLA、THLB、ACOX3、DBP、SCPx等基因mRNA表达情况；观察甘油三酯合成酶基因DGAT1和DGAT2的mRNA表达情况。
　　 方法：
　　 1.实验动物分组及标本处理
　　 根据本试验室王晓凌等的造模方法，以8周龄雄性SD大鼠为实验对象，用高脂饮食（脂类以猪油为主，热量比占59.8％）复制胰岛素抵抗模型；在胰岛素抵抗的基础上，一次性注射小剂量STZ复制2型糖尿病大鼠模型。大鼠血清，用于血糖、总游离脂肪酸的测定；心肌组织，用于总游离脂肪酸的测定和总RNA的提取。
　　 2.血糖的测定
　　 用HITACHI7170A型全自动生化分析仪，葡萄糖氧化酶法测定血糖，结果以mmol/L表示。
　　 3.血清和心肌总游离脂肪酸的测定
　　 用南京建成的游离脂肪酸试剂盒，铜显色法测定血清和心肌组织总游离脂肪酸含量。血清总游离脂肪酸用mmol/L表示，心肌组织总游离脂肪酸以mmol/gprot表示。
　　 4.心肌组织基因mRNA表达的测定
　　 用Promega总RNA提取试剂盒提取心肌组织总RNA。以18S rRNA做内参，real-time PCR测定PPARα、M-CPT1、ACOX1、LBP、THLA、THLB、ACOX3、DBP、SCPx、DGAT1和DGAT2 mRNA的相对表达量。
　　 5.数据处理
　　 数据用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均与对照组比较，用student's t检验（双尾），检验以P<0.05为差异有显著性意义。
　　 结果：
　　 1.造模
　　 1.1 OGTT试验验证胰岛素抵抗
　　 我室王晓凌等已经通过OGTT、ISI和血糖钳实验证实，大鼠于高脂喂养8周时产生明显胰岛素抵抗，因此，本实验中，只用OGTT试验验证胰岛素抵抗的产生。
　　 胰岛素抵抗组的糖耐量曲线下面积（AUC）平均值为31.138±1.797mmol/L*h，高于对照组27.822±1.271mmol/L*h，差异有统计学意义（P<0.01）。（AUC=0.5×空腹血糖+30 min血糖+1.5×60 min血糖+120 min血糖）。表明，胰岛素抵抗产生。
　　 2.血糖变化
　　 对照组为5.0±0.4mmol/L，单纯胰岛素抵抗组为5.5±0.3mmol/L，糖尿病组为12.7±1.9mmol/L，单纯胰岛素抵抗组与对照组相比空腹血糖增加，差异有统计学意义（P<0.01）；糖尿病组和对照组相比，空腹血糖增加，差异有统计学意义（P<0.01）。表明糖尿病大鼠造模成功。
　　 3.血清总游离脂肪酸的变化
　　 3.1 血清总游离脂肪酸
　　 对照组为0.73±0.25mmol/L，单纯胰岛素抵抗组为1.41±0.31mmol/L，糖尿病组为1.57±0.16mmol/L，与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组血清总游离脂肪酸增加，差异有统计学意义（P<0.01）。表明大鼠整体脂肪酸代谢处于紊乱状态。
　　 3.2 心肌总游离脂肪酸
　　 对照组为0.29±0.05mmol/L，单纯胰岛素抵抗组为0.49±0.17mmol/L，糖尿病组为0.49±0.11mmol/L，与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组血清总游离脂肪酸增加，差异有统计学意义（P<0.01）。表明大鼠心肌脂肪酸代谢处于紊乱状态。
　　 4.心肌组织各目的基因mRNA的相对于内参18sRNA的表达量的变化
　　 4.1 PPARα mRNA的相对表达量
　　 对照组为1.19±0.29，单纯胰岛素抵抗组为1.32±0.40，糖尿病组为1.00±0.17。糖尿病组、单纯胰岛素抵抗组与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。
　　 4.2 m-CPT1 mRNA的相对表达量
　　 对照组为6.9±1.3，单纯胰岛素抵抗组为7.6±1.9，糖尿病组为8.5±1.2。糖尿病组比对照组表达高（P<0.05），单纯胰岛素抵抗组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。表明，糖尿病大鼠心肌线粒体长链脂肪酸的β氧化活性可能增强，胰岛素抵抗大鼠线粒体长链脂肪酸的β氧化活性无变化。
　　 4.3.ACOX1 mRNA的相对表达量
　　 对照组为4.6±0.3，单纯胰岛素抵抗组为5.6±1.2，糖尿病组为5.0±0.9。ACOX1。糖尿病组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），单纯胰岛素抵抗组比对照组表达高（P<0.01）。
　　 4.4 LBP mRNA的相对表达量
　　 对照组为0.098±0.029，单纯胰岛素抵抗组为0.119±0.037，糖尿病组为0.148±0.022。糖尿病组比对照组表达（P<0.01），单纯胰岛素抵抗组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。
　　 4.5 THLA mRNA的相对表达量
　　 对照组为2.3±0.9，单纯胰岛素抵抗组为3.6±1.4，糖尿病组为3.7±1.7。糖尿病组比对照组表达高（P<0.05），单纯胰岛素抵抗组也比对照组表达高（P<0.05）。
　　 4.6 THLB mRNA的相对表达量
　　 对照组为3.2±1.7，单纯胰岛素抵抗组为3.1±1.6，糖尿病组为2.6±0.3。糖尿病组和单纯胰岛素抵抗组与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。
　　 4.10 DGAT1 mRNA的相对表达量
　　 对照组为0.3823±0.0698，单纯胰岛素抵抗组为0.6946±0.1632，糖尿病组为0.4806±0.0019。DGAT1的相对表达量，糖尿病组与对照组相比增加（P<0.01），单纯胰岛素抵抗组与对照组相比增加（P<0.01）。
　　 4.11 DGAT2 mRNA的相对表达量.
　　 结论：
　　 1.2型糖尿病大鼠，心肌脂肪酸β-氧化的增强与PPARαmRNA表达无关；但线粒体脂肪酸β-氧化的增强与m-CPT1 mRNA表达增加有关，过氧化物酶体脂肪酸β-氧的增强与ACOX3、DBP、LBP、THLA和SCPx mRNA表达增加有关。
　　 2.胰岛素抵抗大鼠，心肌脂肪酸β-氧化的增强与PPARαmRNA表达无关；线粒体脂肪酸β-氧化的增强与m-CPT1 mRNA无关；但过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的增强与ACOX1、ACOX3，DBP和THLA mRNA表达增加有关。
　　 3.胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠，心肌甘油三酯合成异常的增加与甘油二酯合成途径的限速酶DGAT1和DGAT2 mRNA的表达增加有关。

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结果

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结论

参考文献

综述 PPARα与糖尿病心脏病变的关系

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