丰富环境降低MPTP诱导的SAMP8小鼠黑质多巴胺系统损伤及机制探讨

摘要

帕金森病（PD）是以黑质纹状体通路多巴胺能神经元变性为特征的中老年常见的神经系统变性疾病，居神经系统退行性疾病第二位，65岁以上患病率近1～2％。当前PD的治疗方法有多种，大多数以多巴胺替代治疗为主，这类药物虽在大多数早期病例有效，但并不能减缓中脑黑质多巴胺神经元退行性变的进程。而且，过量的多巴胺可加速黑质神经元的氧化损伤。为了长期对抗黑质神经元减少引起的症状，一些非药物性治疗方法已经有了一定发展，但由于手术创伤大，使用对象局限。所以寻找可以缓解黑质多巴胺细胞变性的方法对防治PD至关重要。
　　 流行病学研究显示，环境毒素增加了许多神经疾病的风险。制作PD模型的方法之一是应用MPTP，能产生可靠的、复制性良好的黑质纹状体多巴胺能通路损害，导致人类及多种动物产生PD症状。MPTP在胶质细胞MAO-B的作用下转化为MPP+，MPP+通过多巴胺转运体（DAT）进入神经元并干扰复合体Ⅰ的活性。DAT对于MPTP毒素的摄入起着很重要的作用。
　　 PD的发病率随年龄的增长逐渐增高，衰老是PD重要的危险因素。在环境毒物作用下衰老的动物更易发生PD。SAMP8小鼠为快速老化小鼠，其平均寿命约12个月，4-6个月成熟期后迅速衰老，是研究衰老及衰老相关性疾病的很好的动物模型。用MPTP干预SAMP8造成小鼠PD模型，体现了衰老和环境因素共同作用的结果，在模拟PD的发病和临床特征方面比单因素造成PD模型更有优越性。
　　 近年来，国内外学者开展了不少关于神经可塑性方面的研究。神经营养因子对神经元的发育、生长和存活都是必要的。生长相关蛋白（GAP43）位于神经元轴突生长锥质膜，能启动生长锥形成，引导轴突生长，调节轴突形成新的突触联系，近年国际上已将GAP43作为研究神经生长发育等神经可塑性的首选分子标志物。突触蛋白Ⅰ（SYNⅠ）是突触前磷蛋白，修饰递质释放、突触前结构的形成和维持及轴突延伸，有学者认为突触蛋白Ⅰ可作为中枢神经系统中突触功能建立与否的敏感指标。
　　 几十年来的研究证实了丰富环境对行为学功能尤其是学习记忆功能的促进作用。复杂的环境能改善实验动物的脑功能，加强其在复杂的行为学测试中解决问题的能力。目前，丰富环境已用于脑损伤、脑卒中等研究领域。本课题选择SAMP8小鼠作为研究对象，探讨MPTP-SAMP8-PD模型的可行性；并进一步探讨丰富环境在保护SAMP8小鼠、降低MPTP诱导黑质多巴胺神经元损伤中的作用及机制，为应用丰富环境预防、延缓PD的发生提供临床依据。
　　 第一部分 MPTP对SAMP8小鼠行为学及黑质多巴胺系统的损伤
　　 目的：通过行为学、分子生物学、形态学检测，探讨MPTP对6月龄SAMP8小鼠行为学及黑质多巴胺神经元的损伤。
　　 方法：40只6月龄雌性SAMP8小鼠随机分为：实验组（MPTP组）和盐水对照组（NS组），每组20只。实验组小鼠皮下注射MPTP（14 mg/kg/2h，注射4次），盐水组小鼠皮下注射等量的生理盐水。MPTP注射后1-2天测试小鼠的自主活动能力；MPTP注射后1-5天用Morris水迷宫测试小鼠的寻找平台潜伏期及搜索策略。第7天取鼠脑用RT-PCR观察黑质酪氨酸羟化酶（TH）mRNA的变化；免疫组织化学观察黑质TH表达的变化。
　　 小结：SAMP8小鼠皮下注射MPTP可引起自主活动减少、空间学习和记忆能力下降、黑质多巴胺能神经元减少，成功模拟了帕金森病的症状及病理改变。
　　 第二部分丰富环境对黑质多巴胺神经元的保护作用
　　 目的：探讨丰富环境在SAMP8-MPTP模型鼠中对黑质多巴胺神经元的保护作用。
　　 方法：80只3月龄雌性SAMP8小鼠随机分为丰富环境组（EE组）和标准环境组（SE组）。饲养3个月后，做行为学实验（自主活动实验、高架十字迷宫实验、Morris水迷宫实验）。EE组和SE组小鼠分别随机分为MPTP组和盐水对照组（NS组），每组20只。MPTP组小鼠皮下注射MPTP（14 mg/kg/2 h，注射4次），NS组给予皮下注射等量的生理盐水。MPTP干预后1-2天做自主活动实验、高架十字迷宫实验，1-5天做Morris水迷宫实验。MPTP注射后第7天取鼠脑用RT-PCR观察黑质TH mRNA的变化；免疫组织化学观察黑TH表达的变化。
　　 小结：丰富环境使SAMP8小鼠自主神经功能更加稳定并能提高学习记忆能力。MPTP注射后，SAMP8小鼠自主活动下降、焦虑增加、学习记忆能力下降；标准环境组小鼠与丰富环境组比较，行为学的改变更明显。丰富环境可降低黑质DAT mRNA及蛋白表达。MPTP注射后，丰富环境组TH mRNA及蛋白表达高于标准环境组。丰富环境可保护黑质多巴胺神经元抵抗MPTP的损伤。
　　 第三部分丰富环境对SAMP8小鼠黑质BDNF的影响
　　 目的：观察丰富环境对SAMP8小鼠黑质BDNF的影响，探讨丰富环境保护黑质多巴胺神经元降低MPTP损伤的机制。
　　 方法：第二部分中80只3月龄雌性SAMP8小鼠随机分为丰富环境组（EE组）和标准环境组（SE组）。饲养3个月后，EE组和SE组小鼠分别随机分为MPTP组和盐水对照组（NS组），每组20只。MPTP组小鼠皮下注射MPTP（14 mg/kg/2 h，注射4次），NS组给予皮下注射等量的生理盐水。MPTP注射后第7天取鼠脑用RT-PCR观测黑质BDNF mRNA的变化；免疫组织化学观察黑质BDNF-ir表达的变化。
　　 小结：丰富环境能明显增加SAMP8小鼠黑质BDNF mRNA表达及BDNF-ir阳性细胞表达。MPTP干预后，丰富环境组SAMP8小鼠黑质BDNF mRNA表达及BDNF-ir阳性细胞表达明显高于标准环境组。
　　 第四部分丰富环境对SAMP8小鼠黑质GAP43、突触蛋白Ⅰ的影响
　　 目的：观察丰富环境对SAMP8小鼠黑质GAP43、突触蛋白Ⅰ的影响，进一步探讨丰富环境保护黑质多巴胺神经元降低MPTP损伤的机制。
　　 方法：第二部分中80只3月龄雌性SAMP8小鼠随机分为丰富环境组（EE组）和标准环境组（SE组）。饲养3个月后，EE组和SE组小鼠分别分为MPTP组和盐水对照组（NS组），每组20只。MPTP组小鼠皮下注射MPTP（14 mg/kg/2 h，注射4次），NS组给予皮下注射等量的生理盐水。MPTP注射后第7天取鼠脑用RT-PCR观测黑质GAP43 mRNA、SynapsinⅠ mRNA的变化；免疫组织化学观察黑质GAP43、SynapsinⅠ表达的变化。
　　 小结：丰富环境能明显增加SAMP8小鼠黑质区GAP43 mRNA及GAP43-ir阳性表达。MPTP干预后，黑质区GAP43 mRNA及GAP43-ir阳性表达明显升高，以丰富环境组黑质区GAP43 mRNA及GAP43-ir阳性表达升高明显。丰富环境能明显增加SAMP8小鼠黑质区SynapsinⅠ mRNA及SynapsinⅠ-ir阳性表达。MPTP干预后，黑质区SynapsinⅠ mRNA及SynapsinⅠ-ir阳性表达明显下降，但丰富环境组SAMP8小鼠黑质区SynapsinⅠ mRNA及SynapsinⅠ-ir阳性表达明显高于标准环境组。
　　 结论:SAMP8小鼠皮下注射MPTP每次14 mg/kg，连续注射4次，每次间隔2小时，能够产生类PD模型的改变。丰富环境对黑质多巴胺能神经元具有保护作用，能降低MPTP诱导的黑质多巴胺神经元的损伤。而这可能与丰富环境能增加黑质区BDNF、GAP43、SynapsinⅠ的mRNA及蛋白表达，增加神经可塑性有关。同时丰富环境能降低黑质区DAT的mRNA及蛋白表达，减少毒物对多巴胺能神经元的损伤。本实验能够为防治PD提供一定的理论依据，丰富环境可以作为一种预防PD的非侵袭性、非药物性手段。

目录

文摘

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论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分 MPTP对SAMP8小鼠行为学及黑质多巴胺系统的损伤

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 丰富环境对黑质多巴胺能神经元的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 丰富环境对SAMP8小鼠黑质BDNF的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 丰富环境对SAMP8小鼠黑质GAP43及突触蛋白Ⅰ的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 动物模型SAMP8小鼠及其相关研究进展

综述二 丰富环境与神经可塑性

致谢

个人简历