肿瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌组织和细胞系中的表达及功能研究

摘要

目前以肿瘤免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已经成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式，研究和开发新型肿瘤疫苗已经成为近年国际上肿瘤免疫治疗的热点之一。在目前已知的众多肿瘤相关抗原中，癌睾丸抗原（CTA）有其特异的表达模式，即在各种肿瘤组织中有不同频率的表达，而在正常组织中仅在睾丸生殖细胞中表达，偶然在胎盘中表达。但睾丸是免疫豁免器官，不引起机体特异性免疫反应。因此，CTA适于作为特异性肿瘤免疫治疗的靶抗原。
　　 作为CTA亚家族的黑色素瘤抗原基因（MAGE）是从黑色素瘤细胞中分离出来的一大家族抗原基因，其编码的肿瘤排斥抗原在细胞内经加工产生抗原肽，并与HLA-Ⅰ类分子结合形成复合物，能够被自体细胞毒性T细胞识别，诱导出对相应肿瘤细胞的特异性杀伤。MAGE基因在许多肿瘤组织中有较高的表达，但在正常组织（除睾丸和胚胎外）均不表达，因此可作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。深入研究MAGE基因的功能将会为开展肿瘤分子学诊断和肿瘤免疫治疗的临床应用奠定良好的基础。
　　 有研究提示，MAGE-A4可能表现了与该家族中其它成员不同的分子生物学特性，但是其具体的生物学功能和分子机制到目前还不十分清楚。本研究采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测了MAGE-A4 mRNA在77例乳腺癌良恶性组织及乳腺癌细胞系中的表达；构建了同时表达MAGE-A4和FLAG标签的表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通过MTT分析和克隆形成实验研究了MAGE-A4过表达对MAGE-A4低表达的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响；采用荧光素酶报告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成实验和TUNEL染色法检测了MAGE-A4对p53转录活性的影响；采用细胞质与细胞核分离实验检测了MAGE-A4在细胞中的定位；采用免疫荧光染色技术检测了MAGE-A4与p73蛋白在细胞中的共定位；采用免疫共沉淀技术检测了MAGE-A4与p53家族成员之间的物理性结合；利用siRNA技术研究了抑制MAGE-A4基因对高表达MAGE-A4的乳腺癌细胞系凋亡的影响。主要研究内容和结果如下：
　　 第一部分：肿瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌组织和细胞系中的表达
　　 目的：通过检测MAGE-A4在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织及六种乳腺癌细胞系中的表达，探讨其表达与乳腺癌临床指标及生物学行为的关系
　　 方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术从转录水平上检测MAGE-A4在乳腺正常组织、癌旁组织和癌组织及六种乳腺癌细胞系中的表达，并回顾性分析其表达与乳腺癌临床指标与生物学行为（包括患者年龄、肿瘤大小、TNM分期、病理类型、组织学分级、腋淋巴结转移状况、有否脉管瘤栓、ER/PR和HER-2表达）的关系。
　　 结论：
　　 1.正常乳腺组织中无MAGE-A4 mRNA表达；乳腺癌旁组织中MAGE-A4 mRNA表达阳性率为5.19％；乳腺癌组织中MAGE-A4 mRNA表达阳性率为42.9％。提示MAGE-A4可作为肿瘤特异性抗原。
　　 2.MAGE-A4 mRNA表达与乳腺癌患者的肿瘤大小、临床分期、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、脉管瘤栓、ER/PR及HER-2状态无明显相关性,但与患者的年龄存在明显的相关性。60岁以上乳腺癌患者肿瘤组织中MAGE-A4mRNA表达阳性率明显高于60岁以下乳腺癌患者。
　　 3.六种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-453和MDA-MB-468中均无MAGE-A4 mRNA表达；MDA-MB-436中MAGE-A4 mRNA呈高表达。
　　 第二部分：FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达载体的构建及功能分析
　　 目的：构建带有FLAG标签的MAGE-A4基因表达载体，并研究其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
　　 方法：利用巢式PCR及基因重组技术构建带有FLAG标签的MAGE-A4基因表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通过克隆形成实验和MTT法研究MAGE-A4过表达对MAGE-A4低表达的乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
　　 结论：
　　 1.成功构建了MAGE-A4基因表达载体FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并且构建好的载体在体外表达阳性。
　　 2.外源性MAGE-A4可以抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖。
　　 3.外源性MAGE-A4增加了阿霉素诱导的MCF-7细胞的死亡率；但对MDA-MB-231细胞没有显著影响。
　　 第三部分：MAGE-A4与p53家族之间关系的研究
　　 目的：研究MAGE-A4对p53转录活性的影响，MAGE-A4是否与p53家族成员之间存在直接的物理结合，进而证实MAGE-A4的功能发挥是否部分或全部通过p53通路而完成。
　　 方法：采用荧光素酶报告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成实验和TUNEL染色法检测MAGE-A4对p53转录活性的影响；采用细胞质与细胞核分离实验检测MAGE-A4在细胞中的定位；采用免疫荧光染色技术检测MAGE-A4与p73蛋白在细胞中的共定位；采用免疫共沉淀技术检测MAGE-A4与p53家族成员之间的物理性结合。
　　 结论：
　　 1.MAGE-A4可以增加p53的转录活性。
　　 2.MAGE-A4可以通过增加p53转录活性而产生抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的功能。
　　 3.MAGE-A4在细胞质和细胞核中均有表达。
　　 4.p73和MAGE-A4在细胞核中存在共定位。
　　 5.p53和MAGE-A4蛋白之间以及p73和MAGE-A4蛋白之间均存在物理性结合。MAGE-A4蛋白通过和p53家族成员之间的直接结合而发挥生物学功能。
　　 第四部分：MAGE-A4siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响
　　 目的：检测靶向MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响。
　　 方法：采用MAGE-A4 siRNA转染抑制乳腺癌细胞MDA-MB-436中MAGE-A4的表达，然后使用顺铂诱导细胞凋亡，利用TUNEL染色法、流式细胞分析技术及检测PARP蛋白裂解来分析MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响。
　　 结论：
　　 1.靶向MAGE-A4 siRNA转染对MDA-MB-436细胞MAGE-A4表达有明显的抑制效果。
　　 2.MDA-MB-436对阿霉素耐药，而对顺铂较敏感。
　　 3.靶向MAGE-A4 siRNA转染可降低MDA-MB-436对CDDP诱导的凋亡，提示：MAGE-A4在一定程度上发挥肿瘤抑制因子的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

引言

第一部分肿瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌组织和细胞系中的表达

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表达载体的构建及功能分析

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分MAGE-A4与p53和p73之间关系的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分MAGE-A4 siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-436凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述MAGE-A基因家族与肿瘤关系的研究进展

致谢

个人简历