葡萄糖和醛固酮对心脏成纤维细胞增殖的影响

摘要

目的:肾素-血管紧张素-醛固酮系统似乎参与啮齿类动物的心脏纤维化过程,表现为非上皮细胞的增殖和细胞外基质的改变,且在许多实验研究中高浓度葡萄糖同样可以促进心脏成纤维细胞的增殖。但高浓度葡萄糖和醛固酮对心脏成纤维细胞的增殖是否具有协同作用,结论并不一致。因此本研究以新生SD大鼠的心脏成纤维细胞为模型,研究不同葡萄糖浓度和醛固酮对新生大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响,为心脏纤维化的发生提供新的认识。
　　 方法:
　　 1实验动物:出生1-3d的SD大鼠,雌雄不限,购于河北医科大学动物动中心。
　　 2心脏成纤维细胞的培养:无菌条件下取出生1-3天的SD大鼠心脏,胰蛋白酶消化心脏组织后取消化液,经过滤、离心将所得细胞种植于含培养液的培养瓶中,将培养瓶放在5％CO2、37℃培养箱孵育40分钟后,弃去上层培养液和未贴壁细胞,所得细胞基本为成纤维细胞。更换培养液,继续培养,每隔一天换培养液.当细胞生长至亚融合状态时,以1×105/ml密度传代,实验所用细胞均为第二代细胞。
　　 3免疫组织化学观察:取24孔板,每孔内放一片盖玻片,将心脏成纤维细胞接种于孔内盖玻片上,置培养箱内培养。细胞充分附着贴壁后,取出盖玻片用PBS液清洗两遍,4％多聚甲醛固定,按免疫组织化学染色采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶(ABC)法进行免疫细胞化学染色并于显微镜下观察。
　　 4实验分组:将生长状态一致、处于对数生长期的第二代细胞随机分为九组:
　　 (1)低糖组(5.6 mmol/L D-葡萄糖)
　　 (2)低糖+10-7mol/L醛固酮(Ald)组
　　 (3)低糖+10-7mol/L Ald+10-6mol/L螺内酯(Spi)
　　 (4)高糖A组(15 mmol/L D-葡萄糖)
　　 (5)高糖A+10-7mol/L Ald组
　　 (6)高糖A+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 (7)高糖B组(25 mmol/L D-葡萄糖)
　　 (8)高糖B+10-7mol/L Ald组
　　 (9)高糖B+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 各组的培养液均为无血清等渗培养液。
　　 5 Brdu、WST-1 ELISA法同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成和代谢活性:
　　 将生长良好的第一代细胞消化、收集、记数,调整浓度后接种于96孔板,每孔5000-6000个细胞。37℃、5％CO2及饱和湿度下培养24小时,弃去各孔培养液,以无血清低糖DMEM培养液培养24小时,使细胞进入静止生长期。采用三种D-葡萄糖浓度培养液(5.6 mmol/L,15 mmol/L,25 mmol/L)、醛固酮(10-7mol/L)及螺内酯(10-6 mol/L)干预24小时,其中用L-葡萄糖调节三种培养液使其渗透压相等。按试剂盒说明书采用WST-1、Brdu掺入法同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成和代谢活性。
　　 6统计学处理:
　　 实验数据用SPSS13.0软件进行统计分析,结果以均值±标准差(-x±s)表示。多组均数比较采用单因素方差分析,组与组之间分析采用多组均数的两两比较。交互作用采用两因素方差分析,P＜0.05表示有显著性差异。
　　 结果:
　　 1心脏成纤维细胞的鉴定:免疫细胞化学染色,光镜下见细胞呈梭形或多角形,纤维连接蛋白染色呈阳性,胞浆内围绕胞核呈现棕黄色细密颗粒,呈细丝状,PBS对照呈阴性,符合成纤维细胞的染色特征。免疫组化抗波形蛋白、纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的心肌成纤维细胞,纯度达94％。
　　 2不同糖浓度对成纤维细胞增殖的影响:WST-1和Brdu结果表明,与低糖组(5.6 mmol/L)比较,高糖组(15 mmol/L、25 mmol/L)细胞的代谢活性和DNA合成均显著增高(P＜0.01)。但高糖两组之间差异无统计学意义。
　　 3醛固酮在不同糖浓度时对成纤维细胞增殖的影响:WST-1和Brdu结果表明,与低糖组(5.6mmol/L)比较,低糖+10-7mol/L醛固酮组细胞的代谢活性和DNA合成均明显增高(WST-1,P＜0.01;Brdu,P=0.019)。但高糖(A、B)+10-7mol/L醛固酮组与对应的高糖(A、B)组比较差别均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4螺内酯对醛固酮刺激成纤维细胞增殖的影响。
　　 WST-1和Brdu结果表明,在不同糖浓度,与加醛固酮组比较,螺内酯均能显著抑制醛固酮引起的细胞代谢活性增强(P＜0.05),但对DNA合成的抑制并不明显(P＞0.05)。
　　 5糖和醛固酮对成纤维细胞增殖的交互作用。
　　 WST-1和Brdu结果表明,不同糖浓度对成纤维细胞代谢活性和DNA合成的影响不同(P＜0.01);10-7mol/L醛固酮对成纤维细胞代谢活性的影响有显著性差异(WST-1,P＜0.05),但其对成纤维细胞DNA合成的影响不明显(Brdu,P＞0.05);两者对成纤维细胞代谢活性的交互作用不明显(WST-1,P=0.085),但对成纤维细胞的DNA合成有交互作用(Brdu,P=0.012)。
　　 结论:葡萄糖及醛固酮均可促进大鼠心脏成纤维细胞增殖,高浓度葡萄糖对成纤维细胞的促增殖作用要比醛固酮(10-7mol/L)明显;螺内酯至少部分抑制醛固酮引起的心脏成纤维细胞增殖,提示醛固酮的刺激增殖作用通过经典的受体途径起作用;当以较高浓度的葡萄糖对心脏成纤维细胞培养时,醛固酮(10-7mol/L)的刺激增殖作用可被掩盖。

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文摘

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:醛固酮对心血管系统的影响

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