α-硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠外周血和中枢MMP-9表达的影响

摘要

目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种病因尚未完全明确的中枢神经系统自身免疫性疾病,以中枢神经系统多发性炎性脱髓鞘、神经胶质细胞增生以及不同程度的轴索损害为主要病理特征。目前众多研究表明多发性硬化患者早期就存在着血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)的破坏,并推测其可能是多发性硬化患者发病过程中的一个关键性的环节。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)通过降解血管内皮细胞中的基质蛋白进而增加微血管内皮的通透性,使T细胞等炎症细胞穿透BBB基底膜,导致BBB破坏。Α-硫辛酸(α-Lipoic acid,α-LA)被誉为“万能的抗氧化剂”,是已知天然的抗化氧剂中抗氧化能力最强的一种,它不仅能够通过清除氧自由基、降低单核细胞的迁移能力,同时还能稳定BBB,进而抵抗单核细胞黏附引起的氧化应激损伤。
　　 本实验旨在通过建立自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠模型,检测EAE大鼠外周血和中枢神经系统(central nervous system,CNS)内MMP-9的表达水平,同时观察α-硫辛酸对EAE大鼠外周血和中枢神经系统内MMP-9表达的影响,进而探讨α-硫辛酸对中枢神经系统损伤可能的保护作用及其机制。
　　 方法:Wistar大鼠共125只,雌性,6-8周龄,体重180～220g,其中80只随机分为2组即EAE组和CFA组,2个组再分别按时间分为免疫后6天组、8天组、10天组、12天组、14天组、16天组、18天组、20天组8个亚组,每个亚组5只。另有45只随机分为3组即对照-EAE组、低剂量-EAE组(免疫后第6天开始给予腹腔注射α-硫辛酸30mg/kg·d)、高剂量-EAE组(免疫后第6天开始给予腹腔注射α-硫辛酸100mg/kg·d),3个组再分别按时间分为免疫后8天组、12天组、20天组3个亚组,每个亚组5只。每天称量体重和作临床评分;取脑组织视交叉和脊髓腰膨大处行HE染色观察炎性细胞的浸润、免疫组织化学染色检测脑组织和脊髓中MMP-9表达量的变化;酶联免疫吸附实验测定血清中MMP-9的含量。
　　 结果:
　　 1发病情况:(Fig.1、2)
　　 EAE大鼠发病急性期的临床表现呈动态性变化,它们大多数在免疫后的第11天开始出现临床症状,病情多在第14天达到高峰,之后逐渐恢复。
　　 2神经功能评分:(Table1)
　　 高剂量-EAE组大鼠发病高峰期时神经功能评分显著低于对照EAE组和低剂量-EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 低剂量-EAE组大鼠发病高峰期时神经功能评分也低于对照EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3组织病理学改变:(Fig.3、4)
　　 EAE组12天组、14天组、16天组、18天组大鼠脊髓和脑组织内均可见不同程度的炎性细胞浸润,尤以14天组(即发病高峰期)大鼠脊髓和脑组织内炎性细胞浸润的程度最为显著,在血管周围出现密集的袖套样炎性细胞浸润。
　　 4免疫组化病理学观察:(Fig.5～10)(Table2～5)
　　 4.1 EAE组和CFA组两组比较
　　 EAE组8天组、10天组、12天组、14天组、16天组大鼠脊髓中MMP-9阳性细胞数显著高于同期CFA组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 EAE组10天组、12天组、14天组大鼠脑组织中MMP-9阳性细胞数显著高于同期CFA组,具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 4.2 EAE组间比较
　　 EAE组10天组与6天组、14天组、18天组、20天组相比较,大鼠脊髓腰膨大处MMP-9阳性细胞数较多,且具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 EAE组12天组与6天组、8天组、14天组、16天组、18天组、20天组相比较,大鼠脑组织视交叉处MMP-9阳性细胞数较多,且具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.3对照EAE组、低剂量-EAE组、高剂量-EAE组三组比较
　　 低剂量-EAE组12天组、20天组与同期对照EAE组相比较,大鼠脊髓MMP-9阳性细胞数并不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　 高剂量-EAE组12天组、20天组大鼠脊髓MMP-9阳性细胞数显著低于同期对照EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 高剂量-EAE组12天组、20天组大鼠脊髓处MMP-9阳性细胞数显著低于同期低剂量-EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 低剂量-EAE组12天组与对照EAE组比较,大鼠脑组织MMP-9阳性细胞数并不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　 高剂量-EAE组12天组大鼠脑组织处MMP-9阳性细胞数显著低于同期对照EAE组,具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 高剂量-EAE组12天组大鼠脑组织处MMP-9阳性细胞数显著低于同期低剂量-EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 5血清中MMP-9含量比较(Table6、7)
　　 EAE组12天组与CFA组12天组相比较,EAE组大鼠血清中具有更高的MMP-9含量,且具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 EAE组12天组与6天组、8天组、10天组、14天组、16天组、18天组、20天组相比较,大鼠血清中MMP-9具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 低剂量-EAE组各组大鼠血清中MMP-9的含量低于同期对照EAE组,具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 高剂量-EAE组各组大鼠血清中MMP-9的含量低于同期对照EAE组具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 1α-硫辛酸可以降低EAE大鼠的发病率,减低疾病本身对机体的神经系统功能损害。
　　 2α-硫辛酸能够降低血脑屏障通透性的标志物MMP-9的水平,具有稳定血脑屏障的作用,提示其在治疗人类MS方面具有很有希望的应用前景。
　　 3α-硫辛酸在治疗EAE大鼠时具有剂量依赖性,大剂量能更有效的抑制疾病的发展,可指导临床用药。
　　 4 EAE发病急性期时外周血和CNS中的MMP-9水平呈现动态变化,且显示与临床表现具有相关性提示其在疾病发生和进展中可能起到了关键性的作用,并可考虑作为该疾病的潜在生物学标记物。

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结果

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讨论

参考文献

综述 基质金属蛋白酶在多发性硬化中的研究进展

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