河北省致手足口病病原谱及病原基因特征分析

摘要

目的：了解河北省手足口病(HFMD)不同病原的流行特征，明确其病原谱及主要病原的基因特征，为河北省手足口病的监测和预防控制工作提供科学依据。
　　 方法：
　　 1、通过流行病学调查，采集HFMD临床诊断病例的粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液和脑脊液标本。
　　 2、针对肠道病毒(EV)5′端非编码区保守基因序列以及EVVP1至2A区基因序列设计EV通用引物和型特异性引物，通过RT-PCR扩增检测HFMD临床诊断病例的标本，并对病原进行分型。
　　 3、将RT-PCR检测为EV阳性的HFMD实验室诊断病例标本接种RD细胞分离病毒；通过RT-PCR法对出现细胞病变(CPE)的标本进行毒株鉴定。
　　 4、针对主要病原EV71和CA16的VP1区全核苷酸序列设计引物，用RT-PCR扩增18株EV71、9株CA16的VP1区，测定其序列，用DNASTAR软件进行核苷酸序列同源性分析并构建系统发生树，对河北省EV71和CA16分离株的基因亚型进行分析。
　　 结果：
　　 1、采用RT-PCR法共检测HFMD临床诊断病例1990份标本，1296份标本EV阳性，阳性率为65.13％，其中752份标本EV71阳性，阳性检出率为37.79％；452份CA16阳性，阳性检出率为22.71％；1份EV71+CA16阳性，阳性检出率为0.05％；91份其他EV阳性，阳性检出率为4.57％。病原构成结果显示，HFMD病原以EV71为主，占阳性病例的58.03％(752/1296)，次之是CA16，占阳性病例的34.88％(452/1296)，其他EV占一定比例，占阳性病例的7.02％(91/1296)。随机抽取55份其他EV阳性标本(42份普通病例、13份重症病例)，进一步分析上述其他EV中病原的构成情况。经RT-PCR和测序进一步分型，除24份未定型外，共鉴定出31份，从构成情况看，CA10占18.18％(10/55)，CA6占14.55％(8/55)，31份，从构成情况看，CA10占18.18％(10/55),CA6占14.55％(8/55)，ECO30占9.09％(5/55),ECO6、ECO9各占3.64％(2/55),CA5、CA14、CB5.ECO14各占1.82％(1/55)，未定型占43.64％(24/55)。结果提示，其他EV中病原构成复杂，涉及多种病毒，本次试验共检出9种，但主要以CA10、CA6、ECO30为主。
　　 2、从不同地区的病原构成情况看，秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区EV71所占比例较高，分别为77.53％、76.18％、69.12％、65.98％；衡水、沧州地区CA16所占比较高，分别为64.29％、51.28％；沧州地区其他EV所占比例相对较高，为33.33％。对55份其他EV阳性标本进一步分型显示，除廊坊、邢台、秦皇岛未分出型别外，其他地区均存在一种或一种以上的其他型别。沧州地区11份标本中，6份为CA10阳性，1份为ECO30阳性；石家庄地区其他EV型别种类较多，13份标本中共检出7种其他型别，分别为CA5、CA6、CA10、CA14阳性各1份，ECO6、ECO9阳性各2份，ECO30阳性3份；邯郸地区7份标本中共检出4种型别，分别为CA6、CA10、ECO30、ECO14阳性各1份。但仍有24份未分出型别。病原构成显示，沧州地区CA10所占比例较高，为54.55％(7/11)，石家庄地区ECO30所占比例较高，为23.08％(3/13)。
　　 3、不同疾病状态病原构成情况检测普通病例1230例，阳性689例，阳性率56.02％，其中EV71阳性260例，占37.74％；CA16阳性362例，占52.54％；其他EV67例，占9.72％，三者之比约为3.9:5.4:1。对42份其他EV进一步分型显示，CA10占19.05％(8/42),CA6占16.67％(7/42),ECO30占7.14％(3/42),ECO9占4.76％(2/42),CA5、CB5、CA14、ECO14各占2.88％(1/42)，未分型占42.86％(18/42)。检测重症病例747例，阳性594例，阳性率79.52％，其中EV71+CA16阳性1例，占0.17％(1/594)；EV71阳性479例，占80.64％(479/594)；CA16阳性90例，占15.15％(90/594)；其他EV24例，占4.04％(24/594)，后三者之比约为20:3.8:1。对13例其他EV进一步分型显示，ECO6.ECO30、CA10各占15.38％(2/13),CA6占7.69％(1/13)，未分型占46.15％(6/13)。检测死亡病例13例，均为EV71阳性。
　　 4、共检测粪便标本141份，101份EV阳性，阳性率为71.63％；肛拭子标本617份，514份EV阳性，阳性率为83.31％；疱疹液标本90份，53份EV阳性，阳性率为58.89％；咽拭子标本1141份，628份EV阳性，阳性率为55.04％；脑脊液1份，未检出病毒核酸。
　　 5、将RT-PCR检测为EV阳性的160份标本接种RD细胞，进行病毒分离，共分离到毒株57株，分离率为35.63％。经RT-PCR和测序鉴定，其中32株为EV71,9株为CA16,8株为CA16+EV71,6株为CA10,1株为CA6,1株为CA5。其中粪便标本接种17份，分离9份，分离率为52.94％；肛拭子标本接种42份，分离15份，分离率为35.71％；疱疹液标本接种11份，分离3份，分离率为27.27％；咽拭子标本接种89份，分离30份，分离率为33.71％；脑脊液标本接种1份，未分离到病毒。
　　 6、18株EV71分离株之间VP1区核苷酸同源性94.4％～99.8％，与全国10个省市分离株的VP1区核苷酸同源性在94.5％～99.6％之间，与A、B基因型代表株VP1区同源性差异较大，核苷酸同源性只在81.7％～82.7％、83.2％～85.1％之间，而与c基因型代表株比较接近，核苷酸同源性在86.6％～99.6％之间，与C1、C2、C3、C4、C5亚型代表株的VP1区核苷酸同源性分别在89％～90.1％、88.1％～90.2％、88％～89.2％、91.9％～99.6％、86.6％～88.2％之间。
　　 7、9株CA16分离株间VP1区核苷酸同源性高达91.4％～99.9％，与A基因型代表株核苷酸同源性较低，为75.4％～77％，与33株B基因型代表株比较接近，核苷酸同源性在88.6％～99％之间。
　　 8EV71和CA16分离株基因分型及系统进化树分析表明，河北省EV71分离株为C4亚型的C4a进化分支，CA16分离株属于B基因型。
　　 9、16株EV71分离株在亚型相关表位的氨基酸组合模式为KADSTV，其余2株为KANSTV和KADSIV组合模式。
　　 1017株EV71分离株在VP1区抗原性表位高度保守，共同序列为EIDLPLEGTTNPNGYA，但2009-hebei-SJ2-120F第93位氨基酸由缬氨酸取代了异亮氨酸(Ⅰ-Ⅴ)。
　　 结论：
　　 1、2009年引起河北省手足口病流行的病原体主要为EV71和CA16，同时还有部分CA5.CA6、CA10、CA14、CB5、ECO6、ECO9、ECO14、ECO30等其他型别，引起河北省重症病例的EV主要型别为EV71。
　　 2、EV71.CA16毒株基因分型及系统进化树分析表明，河北省EV71分离株为C4亚型C4a进化分支，CA16为B基因型。
　　 3、EV71分离株在6个亚型相关位点的主要氨基酸组合模式为KADSTv，还有KANSTV和KADSIV组合模式，为KADST1类似模式的补充模式。
　　 4、绝大部分EV71分离株在主要免疫表位高度保守，其氨基酸序列为EIDLPLEGTTNPNGYA。
　　 5、CA16分离株中发现两个有意义的突变位点，对抗原的空间构象可能会产生一定的影响。

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河北省致手足口病病原谱及病原基因特征分析

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结果

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结论

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综述 手足口病研究进展

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