体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞研究

摘要

目的：对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)进行分离培养和体外传代扩增，并分离大鼠的胰岛细胞，利用大鼠胰岛细胞的微环境，通过共培养体系诱导hUC-MSCs向胰岛样细胞初步转化，探索hUC-MSCs在体外胰岛细胞的微环境中向胰岛样细胞的分化潜能及功能变化趋势。
　　 方法：
　　 1.无菌条件下取足月剖宫产胎儿脐带（获得家属知情同意），自两根脐动脉间沿血管长轴剪开脐带被膜，去掉血管，采用组织块贴壁培养法从人脐带Wharton's Jelly中分离培养MSCs，倒置显微镜下观察其形态变化；传代扩增后经流式细胞仪鉴定CD34抗体、CD45抗体、CD14抗体、CD29抗体、CD44抗体及CD105抗体的表达；
　　 2.采用胶原酶原位灌注消化法和滤网过滤法分离大鼠胰岛细胞，特异性的双硫腙( Dithizon，DTZ)染色进行鉴定；
　　 3.选取状态良好的第3代或第4代hUC-MSCs，以1×105/ml接种于6孔Transwell板的底层（共培养组）和普通6孔培养板（单纯培养组），倒置显微镜下观察细胞贴壁后，将分离获得的大鼠胰岛细胞团以50个/孔接种于Transwell共培养板的insert中，通过共培养体系对hUC-MSCs进行诱导分化，倒置显微镜下观察诱导过程中hUC-MSCs的形态变化；免疫细胞化学法鉴定诱导后hUC-MSCs的胰岛细胞早期标志即胰十二指肠同源框-1基因( Pancreatic Duodenal Homeobox-1，PDX-1)的表达；放免法定量检测单纯培养组和共培养组细胞的胰岛素及C肽分泌水平，观察两组细胞的胰岛素分泌功能变化趋势及对葡萄糖刺激实验的反应性。
　　 结果：
　　 1.利用组织块贴壁培养法从人脐带Wharton's Jelly中分离出的贴壁细胞，倒置显微镜下观察，7天左右可见组织块周围出现贴壁生长的短棒状或梭形样细胞，14天左右细胞形态变为均一的长梭形，20天左右达70-80％融合，可进行传代扩增培养，传代后细胞形态类似成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长；细胞传代培养至第3代，流式细胞学鉴定细胞表面标志，结果高表达间充质细胞的相关表面标志(CD29、CD44、CD105)，几乎不表达与造血细胞相关的细胞表面标志(CD34、CD45、CD14);细胞传代培养至第10代，仍然稳定保持着MSCs的特性。
　　 2.每只体重为250-300g的正常SD大鼠，其胰腺组织经胶原酶原位灌注消化及滤网过滤分离后可获得300个左右的胰岛细胞团，DTZ染色呈棕红色：
　　 3.倒置显微镜下观察，共培养组hUC-MSCs诱导至第3天时，细胞周边突起缩短，形态逐渐变为椭圆形，诱导至第7天时，可见散在的半悬浮生长的胰岛样细胞团，双硫腙染色呈棕红色，诱导至第10天左右，胰岛样细胞团体积变小，形态变得松散不规则，诱导至第14天时，胰岛样细胞团数量减少，体积进一步缩小。单纯培养组的hUC-MSCs在培养过程中形态无明显变化，仍呈长梭形生长；
　　 4共培养组诱导至第3天和第7天时，胰岛样细胞经免疫细胞化学染色鉴定，胰岛细胞早期标志PDX-1表达阳性，诱导至第10天和第14天的胰岛样细胞，PDX-1阳性细胞罕见。单纯培养组PDX-1表达阴性；
　　 5采用放免法在共培养组的培养上清中检测到较高水平的胰岛素及C肽分泌，单纯培养组检测到少量的胰岛素，几乎检测不到C肽。经SPSS13.0统计软件分析，共培养组与单纯培养组相比，细胞培养上清中胰岛素分泌水平在不同的培养时间均有统计学差异(p＜0.01)。共培养组：第3天和第14天的细胞培养上清中胰岛素的分泌量无明显统计学差异(p＞0.05)，但与第7天和第10天相比均有统计学差异(p＜0.05)，第7天的细胞培养上清中胰岛素的分泌水平最高，第10天的分泌量仅次于第7天，但均明显高于第3天和第14天；C肽的检测结果与胰岛素一致。共培养组胰岛样细胞的胰岛素及C肽的分泌水平随体外诱导培养时间的延长，均呈现先递增后递减的趋势；
　　 6选取共培养组和单纯培养组培养至第7天的细胞进行葡萄糖刺激胰岛素释放实验，共培养组的细胞在含葡萄糖1000mg/dl的无血清L-DMEM培养基中检测到胰岛素的分泌量为19.6025±5.9516μIU/ml，在含葡萄糖4500mg/dl的无血清H-DMEM中检测到胰岛素的分泌量为27.6617±7.14825μIU/ml，单纯培养组的细胞在含葡萄糖1000mg/dl的无血清L-DMEM培养基中胰岛素的分泌量为5.8000±1.006μIU/ml，在含葡萄糖4500mg/dl的无血清H-DMEM中检测到胰岛素的分泌量为6.2100±1.1746μIU/ml。共培养组的胰岛样细胞，在高糖和低糖培养基中胰岛素的分泌水平具有明显的统计学差异(p＜0.01)，胰岛素的分泌量随葡萄糖浓度的增加明显增加，胰岛样细胞的葡萄糖刺激指数为1.4372±0.1390。单纯培养组细胞的胰岛素分泌对葡萄糖的刺激变化不大(p＞0.05)。
　　 结论：
　　 人脐带Wharton’s Jelly中分离出的MSCs，采用Transwell共培养体系，在体外胰岛细胞的微环境中具有向胰岛样细胞分化的潜能，其胰岛素分泌功能随着体外诱导培养时间的延长呈现先递增后递减的趋势。

目录

文摘

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体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞研究

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结果

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讨论

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综述 干细胞治疗糖尿病的研究进展

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