黄芩茎叶总黄酮对Aβ致大鼠学习记忆损伤的影响及机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又称老年性痴呆,是引起痴呆的重要疾病来源,随着进入老龄化社会,AD给社会和家庭带来了沉重的负担。自1906年Alois Alzheimer首次命名并报道AD以来,人们一直在寻找其发病机制及预防和治疗措施。尽管AD发病机制目前还不十分明确,但淀粉样蛋白(amyloid protein,Aβ)作为AD发病的始动因子已基本得到认可。Ap25-35是Aβ的功能性片段,体内外实验研究显示了Aβ25-35能引起大鼠海马经元损伤、学习、记忆能力下降。临床药物对老年性痴呆的治疗效果不佳,主要以增强胆碱能神经功能药物为主,国外开发抗AD药物主要集中在通过研究AD发病的分子机制寻找新的靶点及抗氧化植物药,国内主要围绕抗氧化植物药进行开发。黄酮类化合物是自然界分布较广泛的一类次生代谢产物,是植物药抗氧化的一个重要有效成分。黄芩是我国传统的中草药,对黄芩的研究集中在其有效成分黄酮类化合物,研究表明黄芩茎叶总黄酮具有抗炎、抗免疫、保护心肌缺血再灌注损伤、减轻脑缺血引起的损伤等作用。本实验采用大鼠双侧海马内注射淀粉样蛋白(Aβ25-35)制备大鼠痴呆模型,从氧化应激、炎症反应、神经元凋亡等机制观察黄芩茎叶总黄酮(Scutellaria Baicalensis Stem-leaf TotalFlavonoid,SSTF)对Aβ致大鼠学习、记忆能力损伤的影响及机制,以期为抗氧化植物药用于AD的预防、治疗提供实验依据。
　　 第一部分黄芩茎叶总黄酮对Aβ致大鼠学习记忆损伤的影响
　　 目的:观察SSTF对大鼠双侧海马注射Aβ致大鼠学习、记忆能力损伤的影响。
　　 方法:
　　 1实验分组及处理:雄性Wistar大鼠100只,随机分为对照组、模型组、SSTF低、中、高剂量组、VE组,每组16只,对照组、模型组灌胃蒸馏水,其它各组分别灌胃SSTF(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)、VE(10mg/只),灌胃20天,在灌胃一周后对照组大鼠海马注射生理盐水,其它各组注射Aβ,注射Aβ一周后做Morris水迷宫实验,连续做6天后处死。选4只大鼠注射Aβ3天后处死,脑组织外固定后30μm厚连续震荡切片,观察针道。
　　 2模型制备:采用脑立体定位技术,于大鼠AP-3.5mm,ML±2mm,DV2.7mm定位海马CA1区,注射凝胶态Aβ5μl含10μg。
　　 3.Morris水迷宫实验:于大鼠海马注射Aβ一周后做水迷宫实验,每天2次,连续6天,记录大鼠60秒内寻找平台的潜伏期,第6天测定大鼠寻找平台潜伏期后撤去平台,观察大鼠2分钟内穿越平台区域的次数,2分钟内在平台区象限停留的时间,2分钟内大鼠在平台区象限所游路程与总路程比值。
　　 4标本处理:每组取3只大鼠行多聚甲醛灌注进行内固定,取大鼠脑组织进行外固定,石蜡包埋,做HE、硫堇尼氏体染色。刚果红染色确认Aβ注射部位,每组取2只大鼠脑组织做电镜标本。
　　 5统计学处理:采用SPSS11.5统计软件进行分析。
　　 结论:
　　 1大鼠海马注射Aβ可明显降低血清中SOD、GSH-Px、CAT酶的活力,降低大鼠海马、皮层组织中SOD、GSH-Px酶的活力,导致血清、海马及皮层中抗氧化能力降低,氧化产物增多,引起大鼠海马及皮层神经元损伤。SSTF可明显减轻Aβ引起的大鼠血清、海马及皮层中抗氧化酶活力降低,减少氧化产物合成,减轻神经元损伤,具有神经元保护作用,且有一定的剂量依赖性。
　　 2大鼠海马注射Aβ可引起大鼠血清中TNF-α,IL-1β合成增多,SSTF对TNF-α,IL-1β合成无明显影响。
　　 第三部分 SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤的抗凋亡机制研究
　　 目的:分析SSTF对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤作用与神经元凋亡的关系。
　　 方法:
　　 1 TUNEL法检测细胞凋亡。
　　 2免疫组化法检测大鼠海马、皮层组织中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表达,测定切片着色细胞的光密度值。
　　 3 western blotting检测大鼠海马组织中bax、bcl-2、caspase-3、cyt-c表达,测定各指标与β-actin的灰度比值。
　　 结果:
　　 1 TUNEL检测大鼠海马CA1区及皮层神经元凋亡:TUNEL检测显示,大鼠海马CA1区及皮层凋亡的神经元细胞核着棕黄色,模型组大鼠海马CA1区及皮层着色细胞数比对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞数少,着色浅。
　　 对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为7.77,1.34,模型组IOD(40.41,27.73)明显高于对照组;SSTF中、高剂量组较模型组明显降低,SSTF中、高剂量组间有明显差别。
　　 2免疫组化结果:
　　 2.1 bax在大鼠海马及皮层神经元胞浆中呈棕黄色颗粒,模型组大鼠海马CA1区及皮层中着色细胞数较对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组着色细胞数较模型组少,着色浅。
　　 大鼠海马及皮层组织中Bax免疫组化IOD:对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为20.78,13.43,模型组IOD(144.51,57.83)明显高于对照组;SSTF中、高剂量组明显低于模型组;且中、高剂量组间有明显差别。
　　 2.2 Bcl-2在大鼠海马及皮层神经元胞浆中呈棕黄色,模型组海马CA1区、皮层组织中着色细胞数比对照组少,着色浅,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞多,着色深。
　　 大鼠海马CA1区及皮层组织中Bcl-2免疫组化IOD:对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为115.24,31.56,模型组IOD(21.45,2.67)明显低于对照组:SSTF中、高剂量组的IOD明显高于模型组。
　　 2.3 Caspase-3在大鼠海马、皮层神经元胞浆、胞核中均有表达,模型组大鼠海马CA1区及皮层组织着色细胞数比对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞少,着色浅。
　　 大鼠海马CA1区及皮层组织中Caspase-3免疫组化IOD:对照组大鼠海马CA1区及皮层IOD分别为22.47,3.27,模型组IOD(126.28,18.45)明显高于对照组;SSTF中、高剂量组IOD明显低于模型组。
　　 2.4 cyt-c多在大鼠海马及皮层神经元胞浆中表达,呈棕黄色,偶尔也在胞核表达,模型组大鼠海马CA1区及皮层着色细胞较对照组多,着色深,SSTF中、高剂量组较模型组着色细胞少,着色浅。
　　 大鼠海马CA1区及皮层组织中cyt-c免疫组化IOD:对照组大鼠海马CA1区及皮层中IOD分别为25.13,2.86,模型组.IOD(124.79,16.57)明显高于对照组;SSTF中、高剂量组较模型组明显降低。
　　 3 western blotting:
　　 对照组大鼠海马组织中bax/β-actin、caspase-3/β-actin、cyt-c/β-actin分别为0.1027,0.0388,0.6053,模型组(0.2678,0.1660,1.2491)明显高于对照组:SSTF中、高剂量组明显低于模型组。
　　 对照组大鼠海马组织中bcl-2/β-actin为0.4131,模型组(0.2354)明显低于对照组;SSTF高剂量组(0.2964)明显高于模型组。
　　 结论:大鼠海马注射Aβ使促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达上调,bcl-2表达下调,引起海马、皮层组织中神经元凋亡,SSTF能下调促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达,上调bcl-2表达,减轻Aβ引起的的神经元凋亡。
　　 结论:
　　 1大鼠海马注射Aβ引起大鼠学习、记忆能力下降与Aβ引起抗氧化酶活力降低,氧化产物合成增多,引起神经元损伤有关;其次与Aβ引起促炎症因子TNF-α,IL-1β释放,导致其它炎症因子释放有关;氧化产物的增多、炎症因子的释放可刺激促凋亡基因bax、caspase-3、cyt-c表达,抑制抗凋亡基因bcl-2表达,进一步加重神经元损伤。
　　 2黄芩茎叶总黄酮能减轻Aβ引起的大鼠学习、记忆能力下降,且具有剂量依赖性,其机制可能是通过提高抗氧化酶活性,减少氧化产物合成,上调抗凋亡基因表达,下调促凋亡基因表达,减轻神经元损伤,改善大鼠学习、记忆能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

引言

第一部分 黄芩茎叶总黄酮对Aβ致大鼠学习记忆损伤的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

讨论

小结

参考文献

第二部分 黄芩茎叶总黄酮对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤的抗氧化、抗炎机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 黄芩茎叶总黄酮对抗Aβ致大鼠学习记忆损伤的抗凋亡机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 淀粉样蛋白在阿尔茨海默病发病中的作用及机制研究进展

综述二 黄芩茎叶总黄酮的药理作用研究进展

致谢

个人简历