Ang-1在多发性骨髓瘤中的表达和青蒿琥酯、β-榄香烯抗骨髓瘤效应

摘要

第一部分 Ang-1在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义
　　 目的:骨髓血管新生在多发性骨髓瘤(multipie myeloma,MM)的发生、发展和预后中起着重要的作用,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)在此过程中扮演了重要角色。本课题旨在研究Ang-1及其受体Tie-2在MM患者和骨髓瘤细胞株RPMI-8226中的表达情况,探讨其表达水平变化的临床意义。
　　 方法:采用RT-PCR和Western blot法检测112例MM患者、24例非肿瘤患者(下称对照组)以及RPMI-8226细胞株中Ang-1及其受体Tie-2的表达水平,分析阳性率及表达量在MM患者与对照组、MM不同分期问的差异,探讨Ang-1表达与MM患者骨髓微血管密度、临床分期及预后的关系。
　　 结果:MM组Ang-1表达的阳性率、表达量均显著高于对照组(P＜0.05);Ang-1在初治组和复发/难治MM组的表达阳性率无明显差异(P＞0.05),但复发/难治MM组的Ang-1表达量高于初治组(P＜0.05);Tie-2mRNA仅在12例MM患者中检出,对照组未检出。MM患者骨髓微血管密度明显高于对照组(25.21±0.8 vs5.23±0.2,P＜0.01);Ang-1阳性患者的骨髓微血管密度高于Ang-1阴性患者(32.98±1.7 vs16.55±1.3,P＜0.05);Ang-1蛋白在Ⅱ期和Ⅲ期MM患者的表达阳性率差异无统计学意义(52.1％ vs60.9％,P＞0.05),但Ⅲ期MM患者Ang-1蛋白的表达水平明显高于Ⅱ期患者(0.4±0.07 vs0.22±0.04,P＜0.05);初治患者中,治疗无效组Ang-1蛋白表达阳性率明显高于有效组(19.1％ vs70.0％,P＜0.01)。
　　 结论:Ang-1在MM中高表达;Ang-1表达水平与MM临床分期、判断预后及选择靶向治疗有关。
　　 第二部分青蒿琥酯抑制人骨髓瘤细胞诱导的血管新生
　　 目的:观察青蒿琥酯对人骨髓瘤细胞株RPMI-8226细胞诱导的血管新生的影响,并探讨其机制。
　　 方法:采用MTT法观察青蒿琥酯对人骨髓瘤细胞株RPMI-8226细胞增殖的影响;采用HUVEC迁移实验、HUVEC小管成型实验、主动脉环血管生成实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长实验观察青蒿琥酯对RPMI-8226细胞诱导血管新生的影响;采用酶联免疫吸附法检测青蒿琥酯对RPMI-8226细胞分泌VEGF租Ang-1的影响;免疫蛋白印迹法检测青蒿琥酯对RPMI-8226细胞VEGF和Ang-1蛋白表达的影响,
　　 结果:
　　 1青蒿琥酯以时间、剂量依赖方式抑制人骨髓瘤细胞株RPMI-8226细胞增殖。药物作用24 h和48 h后,其IC50值分别为36.33±2.65和14.31±3.28μmol/l。
　　 2青蒿琥酯在较低浓度(2.5μmol/l)即开始对血管内皮细胞迁移有抑制作用;12.5μmol/1时即可抑制内皮小管形成。
　　 3主动脉环血管生成实验结果显示,与单纯RPMI-8226细胞组相比,青蒿琥酯预处理组新生血管形成明显减少,出现时间明显滞后。第14天,单纯RPMI8226细胞组新生血管数为114.5±1.87;3、6和12μmol/l青蒿琥酯预处理组新生血管数分别为60.33±1.86、34.83±2.14和10±1.41,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长实验结果显示,单纯RPMI-8226细胞组具有很强的刺激血管新生能力;而ART处理组的RPMI-8226细胞刺激血管新生能力明显减弱,3、6和12μmol/l青蒿琥酯处理RPMI-8226细胞组与单纯RPMI8226细胞组比较,微血管数目分别减少21.9％,38.24％和76.9％。
　　 5青蒿琥酯抑制人骨髓瘤细胞株RPMI-8226细胞分泌VEGF和Ang-1。与单纯RPMI-8226细胞对照组上清液中VEGF、Ang-1含量(578±26、185.14±32 pg/ml)相比,经3、6和12μmol/l青蒿琥酯处理的RPMI8226细胞条件培养液中VEGF、Ang-1含量下降,分别为502±27、145±21;227±35、65±18:121±14、36±6 pg/ml。
　　 6青蒿琥酯抑制人骨髓瘤细胞株RPMI-8226细胞VEGF和Ang-1蛋白表达。与单纯RPMI8226细胞对照组相比,经3、6和12μmol/l青蒿琥酯处理的RPMI8226细胞VEGF蛋白表达量分别下降28.2％、57.1％和73.6％;Ang-1蛋白表达量分别下降28.9％、44.4％和71.1％,呈剂量依赖性。
　　 结论:青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖;青蒿琥酯抑制人骨髓瘤RPMI-8226细胞诱导的血管新生;青蒿琥酯抗骨髓瘤细胞诱导血管新生的效应与其抑制RPMI-8226细胞的VEGF、Ang-1表达有关。
　　 第三部分β-榄香烯对人骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响
　　 目的:研究β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖、凋亡的影响,探讨其作用的分子机制
　　 方法:用MTT法检测β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖的影响;Annexin V/PI双标流式术和Hoechst33342/PI荧光染色检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞凋亡的影响;Western blot法检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞Bcl-2、Caspase-3、DR-4和NF-κB p65蛋白表达影响。
　　 结果:β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞生长具有明显抑制作用,且呈浓度和时间依赖性(r=0.723,P＜0.05);10～80μmol/L范围β-榄香烯作用48 h后可诱导骨髓瘤细胞凋亡。与对照组凋亡率(5.4％±1.1％)相比,β-榄香烯处理组凋亡率随药物浓度而递增,分别为22.1％±3.8％(10μmol/L)、39.5％±3.1％(20μmol/L)、58.4％±2.8％(40μmol/L)、65.4％±2.1％(80μmol/L)(P＜0.05);β-榄香烯以时间依赖方式上调Caspase-3、DR-4蛋白表达,并可下调Bel-2、NF-κB p65蛋白表达。
　　 结论:β-榄香烯可通过诱导细胞凋亡而有效抑制骨髓瘤细胞增殖;其诱导细胞凋亡与细胞内、外凋亡通路激活、抗凋亡机制被抑制有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

引言

第一部分 Ang-1在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 青蒿琥酯抑制人骨髓瘤细胞诱导的血管新生

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 β-榄香烯对人骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 青蒿琥酯抗肿瘤机制研究进展

综述二 血管发生与多发性骨髓瘤

致谢

个人简历