肿瘤细胞CRT表达对荷瘤小鼠免疫环境的影响及其应用于过继免疫治疗的实验研究

摘要

目的:探讨盐酸米托葸醌(mitoxantrone hydrochloride,MIT)对B16细胞钙网蛋白(CRT)表达的影响,观察高表达CRT的黑素瘤B16细胞膜抗原疫苗对小鼠抗肿瘤免疫反应所产生的影响;同时观察高表达CRT的B16细胞膜抗原冲击后DCs诱导的CTL细胞对荷黑素瘤小鼠的治疗效果。
　　 方法:用MIT处理B16细胞,免疫荧光法检测B16细胞膜表面CRT的表达,检测得知MIT可以上调B16细胞CRT的表达。分别用不同剂量的MIT治疗荷瘤小鼠,用普通B16细胞膜抗原和MIT处理过的B16细胞膜蛋白作为疫苗对荷瘤小鼠模型进行预防接种。体外用普通B16细胞膜抗原和MIT处理过的B16细胞膜抗原分别冲击DCs之后诱导特异性CTLs治疗荷瘤小鼠。流式细胞学观察小鼠肿瘤组织中CRT表达,脾脏不同T细胞比例变化,免疫组化检测小鼠肿瘤内T淋巴细胞、DCs的浸润情况,描计小鼠肿瘤体积曲线,观察对荷黑素瘤小鼠的治疗效果。
　　 结果:
　　 1.分别用0.0μg/ml、0.25μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml浓度MIT处理B16细胞,4组肿瘤细胞CRT的表达阳性率分别为:(29.40±3.57)％;(42.80±4.59)％;(56.20±5.55)％;(72.20±2.94)％,CRT表达均上调(P＜0.05),且CRT表达呈剂量依赖性(P＜0.05)。Western blotting鉴定显示,4.0μg/ml浓度MIT组B16细胞膜CRT相对表达为472±23,0.0μg/ml MIT组B16细胞膜CRT相对表达为117±18(P＜0.01)。
　　 2.用2.0、4.0、8.0mg/kg MIT注射治疗荷瘤小鼠,与对照组相比3种剂量MIT可以不同程度可以提高小鼠模型肿瘤组织CRT表达,流式细胞学检测其CRT表达量分别为:5.134±0.95;7.40±0.86;9.17±1.06,与对照组3.21±1.37相比有显著差别(P＜0.05)。
　　 3.免疫组化实验显示:2.0、4.0、8.0mg/kg MIT组和MIT-B16蛋白疫苗组小鼠模型肿瘤组织内部的DCs数量均显著高于荷瘤对照组小鼠(P＜0.05);2.0、4.0mg/kg MIT组和MIT-B16蛋白疫苗组小鼠模型肿瘤组织内部的T细胞数量均显著高于荷瘤对照组小鼠(P＜0.01)
　　 4.流式细胞学检测小鼠脾脏T淋巴细胞显示:4.0mg/kg MIT组、MIT-B16蛋白疫苗组、B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组小鼠脾脏中CD4+T淋巴细胞比例与荷瘤小鼠相比有显著提高(P＜0.01);2.0、4.0、8.0mg/kg MIT组、MIT-B16蛋白疫苗组、B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组小鼠脾脏中CD8+T淋巴细胞比例与荷瘤小鼠相比有显著提高(P＜0.05)
　　 5.第14日处死小鼠测量肿瘤体积(cm3),各实验组肿瘤体积均明显小于与荷瘤对照组小鼠6.944±0.81(P＜0.01),其中2.0、4.0、8.0mg/kg MIT组小鼠肿瘤体积分别为4.074±0.77、2.35±0.54、1.21±0.39,3组有明显差别(P＜0.05);B16蛋白疫苗组,MIT-B16蛋白疫苗组肿瘤体积分别为4.15±0.57、1.674±0.33,2组有明显差别(P＜0.05);B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组肿瘤体积分别为:1.09±0.25、0.594±0.21,2组有明显差别(P＜0.05);其中各治疗组中MIT-B16-DCs-CTLs组肿瘤体积均小于其他各组(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.MIT能够上调CRT在B16肿瘤细胞表面的表达,相似的MIT可以提高小鼠黑色素瘤组织中CRT的表达,且在小鼠承受的范围内CRT表达呈现剂量依赖性;适当剂量的MIT能够提高小鼠黑色素瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞比例,形成特异性的抗肿瘤免疫。
　　 2.高表达CRT的B16细胞膜蛋白疫苗能够提高肿瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠黑色素瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞比例,改善小鼠机体抗肿瘤免疫环境,对小鼠产生肿瘤特异性保护。
　　 3.利用高表达CRT的B16肿瘤膜抗原冲击后的DCs-CTLs细胞治疗荷瘤小鼠,小鼠脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞比例提高,改善小鼠机体抗肿瘤免疫环境,能够取得理想疗效。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 肿瘤细胞免疫原性死亡及其特征性的抗原表达

致谢

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