SM22α和黄芩苷抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成的分子机制

摘要

血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）增殖与迁移在高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄等血管增殖性疾病的发生发展中具有重要作用。
　　 血小板源性生长因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）是一种强效促有丝分裂剂，是介导VSMC增殖和内膜增生的重要因素之一。PDGF通过VSMC膜上的特异性受体将生长信号跨膜转导至胞内并激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路，包括Ras、Raf、MEK1/2和细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulatedkinase.ERK）1/2的顺序激活，进而促进细胞的增殖与迁移。
　　 平滑肌22alpha（smoothmuscle22alpha，SM22α）是一种actin骨架调节蛋白，特异表达于收缩型VSMC中。以往研究显示，SM22α具有抑制VSMC从收缩型向合成型转化，以及抑制动脉粥样斑块形成的作用。然而，有关SM22α是通过什么机制发挥作用，如何维护VSMC收缩表型稳定性的尚无研究报道。本研究采用过表达或敲低技术，系统观察了SM22α在体内、外抑制VSMC增殖和血管内膜增生的生物活性，并对其作用机制进行研究。在此基础上，比较观察了黄芩苷抑制VSMC的活性和独有的分子机制。
　　 1.SM22α通过阻断Ras-ERK1/2信号通路而抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖1.1SM22α过表达抑制PDGF-BB诱导的VSMC生长首先，构建含有SM22α全长cDNA的腺病毒质粒Ad-SM22α，用其感染VSMC，Westernblot结果显示，SM22α的表达明显增加，并且细胞增殖标志基因PCNA的表达量随着SM22α表达量的增加而减少。细胞计数和MTT分析结果显示，SM22α过表达抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖，其抑制作用具有剂量依赖性。
　　 1.2SM22α过表达抑制PDGF-BB诱导的VSMC细胞周期进程SM22α抑制VSMC生长可能是由于抑制增殖和/或诱导凋亡，流式细胞术检测结果显示，PDGF-BB刺激VSMC24h后，感染Ad-SM22α的VSMC中处于G0/G1期的细胞显著增多；但是，感染Ad-SM22α的VSMC其细胞凋亡和caspases活性与撤血清组和Ad-null感染组相比没有变化。说明SM22α过表达抑制VSMC生长主要是诱导细胞周期停滞在G0/G1期的结果。进一步分析显示，过表达SM22α可降低cyclinD1水平，上调p21和p27的表达。以上结果表明，SM22α过表达抑制VSMC的细胞周期进程。
　　 1.3SM22α通过与Ras相互作用而阻断Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号级联为了确定SM22α是否影响生长信号的转导，观察SM22α对MAPK信号通路的调节作用。发现过表达SM22α显著抑制PDGF-BB诱导的ERK1/2的激活，而对JNK和p38没有影响，而且，过表达SM22α显著抑制ERK1/2的上游激酶MEK1/2和Raf-1的活性。并且，过表达缺失actin结合结构域的突变体SM22α（1-151）亦可显著抑制ERK1/2信号级联的活性和细胞增殖。表明SM22α抑制增殖信号转导的作用不依赖于其actin结合域。用持续激活ERK的pCMV-MEK1质粒转染过表达SM22α的VSMC，结果显示，ERK的激活可以抵消SM22α的抗增殖作用。以上结果表明，SM22α诱导细胞周期阻滞是通过抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路实现的。
　　 Ras是Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路上游的一个重要的信号蛋白，在G1期发展和G1-S期转换过程中具有重要作用。过表达SM22α可轻度上调Ras的表达。交互免疫共沉淀分析和GSTpull-down分析结果均显示，SM22α与Ras直接相互作用，而且，二者相互作用的程度依赖于SM22α的水平。激光共聚焦检测结果亦显示，SM22α与Ras共定位于膜周区域，并且感染Ad-SM22α的VSMC中二者的共定位增加。用TGF-β1或ATRA诱导内源性SM22α高表达后，SM22α与Ras的相互作用亦增加，进一步说明SM22α与Ras相互作用呈SM22α剂量依赖性，而与细胞的表型无关。以上结果表明，SM22α通过与Ras相互作用而抑制Ras募集和激活Raf-1，进而抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路的活化。
　　 1.4敲低SM22α通过激活Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路而促进VSMC增殖利用小干扰RNAsiSM22α敲低VSMC内源性SM22α的表达后，Ras的表达也轻微降低。并且，ATRA刺激诱导的G0/G1期阻滞被消除，进入S期的细胞增多，敲低SM22α还可以抵消ATRA对Raf-1-MEK-1/2-ERK1/2信号通路的抑制作用。该结果佐证了SM22α具有抗增殖活性的观点。
　　 总之，收缩型VSMC标志物SM22α是一种内源性Ras抑制因子，通过阻断Ras-ERK1/2信号级联的诱导，进而阻滞细胞周期进程，抑制VSMC增殖，维持VSMC收缩表型的稳定性。
　　 2.过表达SM22α抑制VSMC迁移和球囊损伤诱导的新生内膜增生2.1过表达SM22α抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生利用大鼠主动脉球囊损伤模型，观察感染Ad-SM22α后，对新生内膜形成的影响。HE染色结果显示，损伤14天或28天后，与未感染组或Ad-null组相比，Ad-SM22α组的血管内膜/中膜（I/M）比值明显降低。免疫组织化学结果显示，Ad-SM22α组的血管新生内膜中SM22α阳性的细胞数明显增多，p27的蛋白水平升高，PCNA的表达减少。结果表明，SM22α过表达可抑制新生内膜的形成。
　　 2.2过表达SM22α抑制球囊损伤激活的Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路为了证明体内SM22α过表达抑制新生内膜增生是否与ERK1/2MAPK信号通路有关，本研究检测了球囊损伤3天时，SM22α对ERKMAPK信号通路的影响。Westernblot结果显示，过表达SM22α的血管新生内膜中损伤诱导的Raf-1-MEK-1/2-ERK1/2通路的活化被抑制。SM22α对膜通路的抑制效应与其抗内膜增生作用具有一致关系，同时也进一步表明，SM22α的抗增殖性质可用于指导设计防治血管再狭窄新型药物。
　　 2.3过表达SM22α抑制VSMC迁移VSMC迁移与细胞增殖是损伤诱导血管内膜增厚的先决条件。本研究还发现，过表达SM22α抑制PDGF-BB诱导的VSMC迁移，其抑制迁移的机制可能与下调VSMC中MMP-9的表达有关，动物实验也显示，球囊损伤3天或28天后，Ad-SM22α感染组的血管壁中MMP-9的表达也明显减少。以上结果说明，过表达SM22α抑制VSMC迁移。
　　 3黄芩苷通过阻断ERK通路和eyelinE-CDK2激活，从而抑制VSMC增殖和血管新生内膜形成3.1黄芩苷抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移以往研究证实，黄芩苷具有抗肿瘤活性，抑制肿瘤细胞的细胞周期进程。本研究首先利用MTT分析检测黄芩苷对PDGF-BB诱导的VSMC增殖的影响，结果显示，黄芩苷可剂量依赖地抑制VSMC增殖，高剂量（40μM和60μM）的黄芩苷几乎完全阻断了细胞的增殖活性。而黄芩苷对静止期的VSMC活力无明显影响。说明本研究所用浓度的黄芩苷没有细胞毒性。流式细胞分析结果显示，黄芩苷预处理后，G0/G1期细胞显著增加，而S期与G2/M期细胞显著减少。Westernblot结果显示，黄芩苷抑制PCNA的表达，诱导p27的表达。上述结果表明，黄芩苷诱导细胞周期阻滞，进而抑制VSMC增殖。
　　 PDGF不仅是强效丝裂原，而且还是一种趋化因子，在介导VSMC向内膜下迁移过程中发挥重要作用。细胞划痕实验结果显示，黄芩苷抑制PDGF-BB诱导的VSMC迁移，与PDGF-BB刺激组相比，黄芩苷预处理组迁移细胞数减少了60％；黄芩苷可降低PDGF-BB诱导的迁移相关蛋白OPN、ICAM-1、VCAM-1和MMP-2的上调。但是，流式细胞术和caspase-3活性分析均说明，黄芩苷对细胞凋亡无明显影响。
　　 3.2黄芩苷抑制VSMC中cyclinE-CDK2复合物的形成和p27的磷酸化
　　 3.3黄芩苷抑制PDGF-BB诱导的PDGFRβ-ERK信号通路激活
　　 3.4黄芩苷抑制球囊损伤介导的新生内膜增生
　　 综上所述，黄芩苷通过阻断PDGFRβ-ERK1/2信号级联的活化，抑制cyclinE-CDK2的激活以及上调p27蛋白水平进而抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖，并且可预防损伤诱导的血管内膜增生。
　　 结论
　　 1.SM22α过表达可以竞争性抑制Ras与Raf-1的结合，阻断Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信号通路，进而阻滞PDGF-BB诱导的VSMC的细胞周期进程，抑制VSMC增殖和迁移。
　　 2.过表达SM22α通过阻断Ras-ERK1/2信号通路，抑制球囊损伤引起的血管新生内膜增生。
　　 3.黄芩苷通过阻断PDGFR介导的MEK1/2-ERK1/2信号通路活化，抑制cvclinE-CDK2激活和上调p27的表达，进而抑制PGDF-BB诱导的VSMC增殖和损伤诱导的血管内膜形增生。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

引言

第一部分 SM22a通过阻断Ras-ERK1/2信号通路而抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 过表达SM22α抑制VSMC迁移和球囊损伤诱导的新生内膜增生

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 黄芩苷通过阻断ERK通路和cyclin E-CDK2激活,从而抑制VSMC增殖和血管新生内膜形成

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

综述 Actin结合蛋白与骨架重构

参考文献

致谢

个人简历