雷公藤甲素与环孢菌素A预防同种异体肌腱移植免疫排斥反应的比较研究

摘要

目的:在手部损伤的病人中,肌腱损伤者约占30％,肌腱缺损并且需要行肌腱移植术者占25％。肌腱缺损修复的传统方法是自体肌腱移植,存在取材有限、并且影响取材部位功能等缺点。50年代以来,开展了同种异体肌腱移植的研究,为肌腱缺损的治疗开劈了一条新的道路;同种异体肌腱供源充足、取材方便、手术时间短,患者痛苦小,新的损伤及供区的功能影响小;由于免疫排斥反应未能解决,使得本顼工作尚未有突破性进展。如何减轻同种异体肌腱移植后引起的免疫排斥反应及其所导致的肌腱粘连问题一直是困扰临床广泛应用的最大难题。
　　 肌腱是规则致密的结缔组织,可分为胶原纤维束,腱基质及腱细胞,腱细胞有分泌基质及胶原的作用。肌腱是供血少、细胞少的组织,属于低抗原性组织,其抗原性主要是组织相容性抗原(HLA),存在于腱细胞的细胞膜上,而胶原纤维无明显的抗原性。有效地降低抗原性的同时保持其活性是关键。同种异体肌腱存在免疫原性。肌腱的腱细胞、基质、胶原成分均能诱发免疫反应。同种异体肌腱制备的目的主要是去除免疫原性,保留移植物的生物力学特性。同种异体肌腱移植作为同种异体移植的一部分,其免疫学机制应遵循同种异体移植的免疫学机制。肌腱移植后也要经历针对移植物的细胞免疫和体液免疫。细胞免疫应答发生于急性反应的早期,在病变组织中常见以单核细胞为主的细胞浸润(其中主要是T细胞)。
　　 本实验通过制备肌腱损伤动物模型,行同种异体肌腱移植后,分别给予雷公藤甲素和环孢菌素A;通过形态组织学、生物力学、外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数及CD4+/CD8+比值检测,观察其抑制免疫反应的机制及效果,为同种异体肌腱的制备提供新的方法。
　　 方法:选用4个月龄健康雄性白色Leghorn鸡90只,平均2.1±0.053Kg。随机分为A、B、C三组,每组30只。A组为雷公藤甲素组、B组为环孢素A组,C组为空白对照组。本实验选用Lenghom鸡左足第Ⅲ、Ⅳ趾为实验模型趾。动物大腿中上部肌肉注射1％氯胺酮(15mg/kg)及安定(1mg/kg),麻醉后常规消毒,取掌侧Bruner's切口,从第一趾间关节到趾尖,长约4.0cm,切开皮肤后沿跖侧腱鞘浅层锐性分离,向侧方翻起皮瓣,暴露跖侧腱鞘,沿腱鞘正中纵行切开,暴露屈趾浅、深肌腱,予屈趾深肌腱两腱系带之间切去长约1.5cm肌腱,将A、B、C三组切取的肌腱互换。三组均以4-0尼龙无损伤缝合线作双“8”字缝合,并在周边加固2针。术后A组:口服雷公藤甲素,100ug/kg/天,术后三周末停药。B组:肌注环孢菌素A,10mg/kg/天,术后三周末停药。C组:不作处理。对进行上述处理的三组肌腱分别行①形态组织学观察:分别在大体、HE染色及电镜三方面进行形态学观察分析;②生物力学测试:用CSS-44020生物力学试验机生物力学试验机对三组肌腱分别行肌腱最大拉伸断裂强度(Pmax),拉断粘连带功耗(W0)测定。③用流式细胞仪进行外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数检测并计算CD4+/CD8+比值。
　　 结果:
　　 (1)形态组织学观察:①大体上:A组断端愈合较好,表面光滑,多为少许粘连或无粘连;B组肌腱愈合好,肌腱表面光滑,断端少许粘连,腱周粘连少;C组肌腱断端愈合可,肌腱表谣不光滑,断端及腱周粘连重。②HE染色:A组肌腱断端的胶原纤维排列整齐,与正常肌腱组织较接近,横切片可见断面胶原纤维排列规则;B组肌腱断端的胶原纤维排列比较齐整,接近正常肌腱组织,横切片可见断面胶原纤维排列比较规范C组肌腱断端的胶原纤维排列趋集中,横切片可见断面胶原纤维排列不整。③透射电镜观察:A组成纤维细胞,胞质内有大量的成池状的粗面内质网,腔内充满了分泌物;成纤维细胞,核大,常染色质丰富,异染色质较少;大量胶原纤维,排列整齐、紧凑。B组新生胶原纤维多排列紊乱;成纤维细胞,粗面内质网丰富,囊腔扩大成池状,巨大,腔内充满合成蛋白;成纤维细胞及其大量成纤维细胞,大量的排列整齐的胶原纤维。C组成纤维细胞,胞质内有少量粗面内质网,囊腔轻度扩张,内含少量合成蛋白;周围的胶原纤维少;胶原纤维中等排列,不整齐。
　　 (2)生物力学测试:三周:肌腱最大拉伸断裂强度(Pmax):除了A、B两组间总体均数差异无统计学意义,其余任两组间总体均数差异均有统计学意义;拉断粘连带功耗(W0):A、B、C三组间总体均数差异均有统计学意义。六周:肌腱最大拉伸断裂强度(Pmax):A、B、C三组间总体均数差异均有统计学意义;拉断粘连带功耗(W0):除了A、B两组间总体均数差异无统计学意义,其余任两组间总体均数差异均有统计学意义。综合两方面测试结果认为A、B两组肌腱生物力学方面无显著差异,A、B两组与C组间有显著差异。
　　 (3)外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数检测;三周:外周血CD4+T淋巴细胞计数,A、B、C三组间总体均数差异均有统计学意义;外周血CD8+T淋巴细胞计数及CD4+/CD比值,除了A、B两组闻总体均数差异无统计学意义,其余任两组间总体均数差异均有统计学意义;六周:外周血CD4+T淋巴细胞计数,A、B、C三组闻总体均数差异均有统计学意义:外周血CD8+T淋巴细胞计数及CD4+/CD8+比值,除了A、B两组间总体均数差异无统计学意义,其余任两组闻总体均数差异均有统计学意义;说明采用口服雷公藤甲素和肌注环孢菌素A法降低了肌腱的免疫原性,减少了免疫排斥反应的发生。
　　 结论:雷公藤甲素同环孢菌素A一样都具有抗免疫排斥作用,雷公藤甲素、环孢菌素A处理同种异体肌腱能够更加完全的去除肌腱免疫原性,而且对细胞基质及胶原纤维没有影响,生物力学性能无改变。几乎完全消除异体肌腱免疫原性,为同种异体肌腱的制备提供了新的方法。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 同种异体肌腱移植免疫学的研究

致谢

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