小剂量复合抗原诱导多病程EAE大鼠长病程中髓鞘损伤及α-硫辛酸的保护作用

摘要

目的：多发性硬化(Multiple sclerosis， MS)是中枢神经系统常见的脱髓鞘疾病之一，其临床特征表现为复发-缓解交替，并进行性加重，但其发病机制尚不十分清楚，因而，目前还没有找到十分有效的治疗方法。病理学研究证实，多发性硬化初期就存在髓鞘损伤，但随着时间的推移髓鞘反复损伤而修复不完全，使得轴索得不到保护，继发性损伤，导致临床症状进行性加重。因此，保护髓鞘、促进髓鞘再生是治疗多发性硬化的有效方法。α-硫辛酸作为一种抗氧化剂、免疫调节剂，可以减轻中枢神经系统的氧化和免疫损伤，进而可能对髓鞘具有一定的保护和促进再生作用。髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein， MBP)是髓鞘的重要组成部分，对髓鞘膜状板层结构的维持有重要作用。当髓鞘结构被破坏时，MBP从髓鞘上游离，造成髓鞘板层松散或脱失。因此，检测脑脊液中MBP的含量变化，可以间接了解中枢神经系统脱髓鞘程度。由于大鼠的脑脊液含量少且不易获取，我们采取直接检测EAE大鼠的腰膨大组织MBP蛋白的含量变化，来直接了解长病程中髓鞘的损伤程度及α-硫辛酸是否对髓鞘损伤有保护作用，并通过检测免疫细胞及细胞因子来探讨多发性硬化的发病机制和α-硫辛酸的保护机制。
　　 方法：实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)是研究多发性硬化的理想动物模型。本实验用小剂量豚鼠脊髓匀浆为抗原免疫雌性Wistar大鼠建立EAE模型，发病后当天开始给予α-硫辛酸（α-lipoic acid， LA）腹腔注射（100mg/kg/d，共7d），并进行长达180天的观察和研究。运用神经功能评分、HE染色、三色染色、电镜、Western Blot等多种方法定性和定量观察大鼠中枢神经系统髓鞘脱失情况来反映LA的治疗效果。同时，运用ELISA检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)的水平，流式细胞术检测调节性T细胞(Tregulatory cells， Treg)即CD4+CD25+Foxp3+T细胞的表达，以对免疫机制进行初步探讨。
　　 结果：
　　 1 自然病程组和LA干预组大鼠的180d的平均每天积累神经功能评分相比P＜0.01有显著差异（图2）。佐剂组无发病。因发病后才给予药物干预，故两组大鼠潜伏期没有明显差别，但复发率相比x2=10.797，P=0.001.P＜0.01有显著差异（表1）。说明LA有减轻EAE病情、减少复发的作用。
　　 2 自然病程组与LA干预组发病后7d时HE染色可见炎细胞浸润和血管袖套现象(图4)。
　　 3 三色染色（图5）和电镜观察（图7）均可见EAE大鼠髓鞘板层松散，电镜观察发病后180d自然病程组髓鞘崩解，有碎片堆积（图8A）；LA干预组髓鞘板层损伤较轻，可见再生的薄层髓鞘（图8B）。佐剂组髓鞘板层致密(图6)。
　　 4 Western Blot显示(表2，图9，图10)发病后7d时三组MBP蛋白表达量无明显差别；与同期佐剂对照组比较自然病程组发病后180d时MBP表达下降，t=6.800,P=0.002,P＜0.01，有明显差异；硫辛酸干预组发病后180d时MBP表达与同期佐剂对照组比较也下降t=3.389，P=0.028,P＜0.05，有统计学差异。自然病程组发病后180d时与硫辛酸干预组同期相比MBP表达更低，t=4.035,P=0.016,P＜0.05有统计学差异。说明LA对髓鞘有远期的保护作用。
　　 5 ELISA检测结果显示(表3、4、5，图11、12、13)：无论自然病程组还是LA治疗组的大鼠血清中TNF-α的表达量在发病后7d和14d都高于佐剂对照组，P＜0.01，有显著差异；LA治疗组7d和14d与同期自然病程组比较均下调，发病后7d(P＜0.01)、发病后14d(P＜0.05)，说明LA对TNF-α有下调作用。TGF-β的表达量无论自然病程组还是LA治疗组的发病后7d和14d都低于佐剂对照组，分别为P＜0.01和P＜0.05:LA治疗组7d和14d与同期自然病程组比都上调，发病后7d(P＜0.01)、发病后14d(P＜0.05)，说明LA对TGF-β有上调作用。流式细胞术检测全血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量与TGF-β水平的变化趋势一致。自然病程组和LA治疗组大鼠于发病后14d较发病后7d时TNF-α有不同程度的降低，TGF-β和CD4+CD25+Foxp3+T有不同程度的上升。说明三因子与疾病的严重程度有关。发病后180d时三组无差别。
　　 结论：
　　 本实验通过长达180d的观察研究发现，在发病起始给予LA治疗可以减轻EAE病情，减少复发，抑制促炎因子，上调抑炎因子，从远期效果来看，LA可以减少MS患者髓鞘的脱失，促进髓鞘再生。提示LA可以作为治疗MS的一种有效药物。

目录

文摘

英文文摘

小剂量复合抗原诱导多病程EAE大鼠长病程中髓鞘损伤及α-硫辛酸的保护作用

引言

第一部分 EAE大鼠模型的诱导及长病程中髓鞘损伤的定性和定量研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 EAE大鼠免疫细胞因子的动态表达及α-硫辛酸的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 α-硫辛酸对多发性硬化髓鞘损伤的保护作用

参考文献

致谢

个人简历