机械力对骶韧带成纤维细胞形态及合成功能的调节

摘要

目的：女性盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)是盆底支持组织因退化、损伤等导致肌肉韧带松弛而引发的一类疾病。其病因学还不十分清楚，研究[1]多指向Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP、TIMP等细胞外基质成分的改变，认为细胞外基质重塑引起组织力学性能的下降是该病的关键因素。所以本研究旨在：
　　 1、研究机械力对非POP患者骶韧带成纤维细胞形态及整合素β1(integrinβ1)、Talin、Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)mRNA表达的调节。
　　 2、研究机械力与细胞外基质重塑的关系。
　　 3、探究机械力在女性盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)发病机制中的作用。
　　 方法：
　　 1、研究对象：选取2009年10月-2010年9月在河北医大二院因非POP(恶性肿瘤除外)行子宫切除手术患者的骶韧带15例，平均年龄49.6±4.26岁，产次2.73±1.27次，体重指数24.75±2.44kg/m2。所有入选者均无结缔组织疾病，术后病理证实为非子宫内膜异位症、非卵巢内分泌性肿瘤等雌激素相关疾病，剔除急慢性盆腔炎和盆腔炎后遗症的患者，剔除有该部位手术史者及近3个月内有雌激素应用史者。
　　 2、取材：经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。所取标本为骶韧带近宫颈部分，筋膜外子宫全切时留取约5mm左右的骶韧带组织，4℃冷盒送实验室，整个取材运输过程小于2小时。整个取材过程要求严格无菌。
　　 3、成纤维细胞的原代培养和鉴定：采用胶原酶消化法和组织块法进行骶韧带成纤维细胞的原代培养，倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。
　　 4、细胞力学实验：采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加载系统，选取15例3～4代指数生长期的骶韧带成纤维细胞通过flexcell-4000柔性基底加载系统加载、加力，加载过程在二氧化碳培养箱内进行。实验样本培养于特制的一次性六孔BioFlex培养板上，材质为可变形的硅胶柔性膜，其上包被有collagenⅠ。加载程序由Flexcercell4000计算机软件自动控制。加载参数：幅度10％，正弦波，0.5Hz，加载时间分为0、4、15、24h，以不加力0小时为对照组，卸载后立即提取RNA，采用荧光实时定量PCR测量机械力对integrinβ1、talin、Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)mRNA表达量的影响。
　　 结果：
　　 1、所培养细胞为成纤维细胞，光镜下细胞以梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连接成网状。免疫组织化学染色中间丝波形蛋白(vimentin)阳性，细胞纯度90.4％，平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色约8.3％阳性率，角蛋白(cytokeratin)染色阴性。
　　 2、应力作用后，细胞的形态和伸展方向发生改变；拉伸前细胞形态多样，梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞，并彼此连接成网状，向各个方向伸展；拉伸4h、15h、24h后细胞均为长梭形，并垂直于最大应变方向取向，以24小时最明显。
　　 3、荧光实时定量PCR结果：应力作用下，integrinβ1 mRNA4h、15h、24h表达量(18.822±0.500，32.527±2.559，40.357±2.140)较0h(1.008±0.059)显著升高，各组间差异均有统计学意义，p<0.01；talin mRNA4h、15h、24h表达量(109.804±4.861，106.574±35.477，863.206±44.298)较0小时(1.009±0.468)显著升高，4h、15h差异无统计学意义，p>0.05，余各组间差异均有统计学意义，p<0.01；Ⅰ型胶原mRNA4h、15h表达量(0.753±0.075，0.701±0.023)较0h(1.000±0.129)下降，差异有统计学意义，p<0.01，加载力24hmRNA表达量(1.113±0.049)回升，与0h差异无统计学意义，p>0.05；Ⅲ型胶原mRNA4h、15h、24h表达量(4.792±0.036，6.146±0.594，5.021±0.594)较0h(1.000±0.249)显著升高，24h与4h差异无统计学意义，余各组间差异有统计学意义，p<0.01；MMP-1mRNA4h、15h、24h表达量(6.233±0.651，23.700±0.900，20.133±0.751)较0h(1.000±0.100)升高，各组间差异有统计学意义，P<0.01。
　　 结论：
　　 1、一定范围的机械应力可以改变细胞的形态和伸展方向，并引起integrinβ1、talin mRNA合成的持续性增加，而Ⅰ型胶原mRNA合成先下降，但在加载力24h后，恢复至原来水平，Ⅲ型胶原、MMP-1 mRNA合成先增加，但在加载力24h后下降。
　　 2、盆底组织细胞外基质重塑是对机械力的适应性反应。
　　 3、机械力在POP的发病机制中有一定的作用。