雷替曲塞对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响及其机制的研究

摘要

目的：胃癌是在世界范围内排名第四位的常见恶性肿瘤，每年有100万的新发病例，其中将近70％发生在发展中国家。2007年，全球范围内大约有80万人死于胃癌。我国胃癌平均年死亡率约为25.2/10万人口。5-氟尿嘧啶(5-Fu)在胃癌的化疗中应用广泛，常需连续或持续静脉滴注，应用不够方便。埋置中心静脉导管解决了此问题，但埋置中心静脉导管同时也增加了护理和费用的问题。雷替曲塞(Raltitrexed)是一种喹唑啉叶酸盐类似物，为一种新型的水溶性胸苷酸合成酶(TS)抑制剂。它无需亚叶酸钙增效，使用方便。目前雷替曲塞主要应用于晚期结直肠癌患者的治疗。在胃癌的研究中，雷替曲塞联合其它细胞毒性药物的临床试验显示是有效的，但尚缺乏大规模临床试验证实。雷替曲塞在胃癌的应用上还值得进一步研究。本研究拟通过建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤实验模型，分别给予雷替曲塞、5-Fu、生理盐水药物干预，初步探索雷替曲塞对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及其机制。
　　方法：1、建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型。2、实验分组及药物干预：将24只成瘤裸鼠模型随机分组为雷替曲塞组、5-Fu组、对照组，每组8只，分别给予裸鼠腹腔注射雷替曲塞(7.5mg/Kg/d)、5-Fu(15mg/Kg/d)、生理盐水，每只0.2ml，连续5天，休息2天后，继续给药5天。监测各组裸鼠体重变化，同时观察裸鼠精神状态、饮食、大便情况。3、评价抑瘤作用：每隔3天用游标卡尺测量裸鼠肿瘤长径(A)和垂直横径(B)，按公式V=A×B2/2计算裸鼠肿瘤体积，并绘制肿瘤体积增长曲线。给药休息2天后，全部裸鼠脱颈椎处死，立即剥离肿瘤，并对肿瘤进行称重，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重*100％。4、流式细胞仪测定瘤细胞的周期分布和凋亡。5、采用RT-PCR、Western blot印迹法检测各组肿瘤p53 mRNA及p53蛋白的表达水平，并比较三组之间的差异。6、统计分析：采用SPSS13.0软件对各组数据进行统计分析。计量数据以x-±s表示，多组样本间均数比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.荷瘤裸鼠体重：雷替曲塞组、5-Fu组和对照组裸鼠体重分别为：19.60±1.78g、17.79±1.16g、21.75±2.13g。雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠体重均明显低于对照组体重，统计学有显著性差异(P<0.01)。且5-Fu组裸鼠体重低于雷替曲塞组裸鼠体重(P<0.05)。
　　2.荷瘤裸鼠瘤体体积：雷替曲塞组、5-Fu组和对照组裸鼠瘤体体积分别为：657.89±59.47 mm3、706.14±64.42 mm3、1232.02±109.69 mm3，对照组裸鼠瘤体体积明显高于雷替曲塞组和5-Fu组，统计学有明显差异(P<0.01)，但雷替曲塞组和5-Fu组瘤体体积之间无统计学意义(P>0.05)。
　　3.荷瘤裸鼠瘤重及抑瘤率：雷替曲塞组、5-Fu组和对照组裸鼠瘤重分别为：0.78±0.06g、0.83±0.08g、1.53±0.13g，雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠瘤重均低于对照组瘤重，统计学有显著性差异(P<0.01)。但雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠瘤重之间无统计学意义(P>0.05)。雷替曲塞组和5-Fu组的抑瘤率分别为49.02％、45.75％。
　　4.荷瘤裸鼠瘤细胞的细胞周期分布和凋亡：雷替曲塞组和5-Fu组瘤细胞的G0/G1期比例较对照组比例明显减低(P<0.01)，而S期比例较对照组明显升高(P<0.01)；但两组之间G0/G1期、S期均无统计学差异(P>0.05)。三组G2/S期比例之间无统计学差异(P>0.05)。三组之间的凋亡率有统计学意义。与对照组的凋亡率相比，雷替曲塞组和5-Fu组的瘤细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)，而雷替曲塞组的瘤细胞凋亡率也高于5-Fu组的凋亡率(P<0.05)。
　　5.雷替曲塞组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：0.521±0.046；5-Fu组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：0.487±0.041；对照组中裸鼠肿瘤p53 mRNA相对表达量为：0.159±0.025。雷替曲塞组裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：0.509±0.049；5-Fu组裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：0.474±0.034；对照组裸鼠肿瘤p53蛋白相对表达量为：0.193±0.021。与对照组相比，雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠肿瘤p53 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，而雷替曲塞组和5-Fu组裸鼠肿瘤p53 mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。RT-PCRI和Western blot印迹法检测的p53 mRNA和蛋白表达结果一致。
　　结论：
　　1.雷替曲塞对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤生长有抑制作用，且与5-Fu抑瘤效果相似。
　　2.雷替曲塞可以诱导人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤细胞周期S期的阻滞，从而抑制细胞增殖。
　　3.雷替曲塞可以诱导人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤细胞凋亡。
　　4.雷替曲塞可通过上调p53 mRNA和蛋白的表达水平来发挥抑瘤作用。