食管癌中端粒酶活性检测及EGCG对其活性的抑制作用

摘要

目的：食管癌(esophageal carcinoma，EC)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是EC高发区，发病率居消化道肿瘤第二位。因此，探讨EC的发病机制，寻找新的治疗靶点及有效的治疗药物，具有十分重要的意义。近年来发现，端粒、端粒酶与恶性肿瘤的发生和发展有密切的关系。本文主要研究肿瘤相关基因端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)基因蛋白在食管癌高发区人群中的表达及其意义，探讨端粒酶在食管癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达及临床意义，以及抗癌药物表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]对食管癌细胞凋亡和端粒酶活性的影响。试图揭示端粒酶与食管癌的关系，并为抗癌药物的使用提供理论依据。
　　方法：⑴应用免疫组化(immunohistochemical，IHC)S-P法观察122例咬检食管组织中的hTERT蛋白表达情况，其中正常36例，不典型增生50例，食管癌36例。⑵端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)分析食管组织标本30例，分为正常组织、癌旁组织、癌组织，检测其端粒酶活性。⑶分别用EGCG(0、25、50、100、200、400mg/L)作用于Ecal09细胞24h、48h、72h，用四甲基偶氮唑蓝(3-[4，5-dimethylthiazol-2-y1]，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法测定EGCG的细胞毒性。⑷不同浓度(0、25、50、100mg/L)EGCG作用Ecal09细胞24h、48h、72h后，流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡及细胞周期。0 mg/L的EGCG组作为实验对照组。实验重复3次。⑸不同浓度(0、25、50、100mg/L)EGCG作用Ecal09细胞24h、48h、72h后，通过端粒酶体外合成端粒重复序列的引物延展方法(TRAP)，进行多聚酶联扩增反应(polymerase chain reaction，PCR)，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上，通过经典的银染技术显色。0 mg/L的EGCG组作为实验对照组。实验重复3次。
　　结果：①免疫组化检测咬检组织122例，正常的食管组织36例中有4例弱阳性；不典型增生组织50例中16例弱阳性6例强阳性；食管癌组织36例中4例弱阳性28例强阳性。结果显示癌组织中hTERT的阳性表达率(88.89％)显著高于不典型增生组织(44.00％)和正常食管粘膜(11.11％)(P<0.01)。②TRAP-PCR银染法检测30例临床食管癌手术标本的端粒酶活性，按临床标准分为正常食管组，癌旁组和食管癌组。食管癌组端粒酶阳性率86.67％(26/30)明显高于癌旁组23.33％(7/30)和正常食管组织0.00％(0/30)(P<0.05)。③分别用EGCG(0、25、50、100、200、400mg/L)作用于Eca109细胞24h、48h、72h，MTT结果显示EGCG能明显抑制Eca109细胞的增殖，并呈剂量和时间依赖性。作用24h、48h、72h后，Eca109细胞半数抑制率(inhibitory concentration giving50％ inhibition，IC50)分别为162.9829mg/L，138.8385 mg/L和109.6057 mg/L(P<0.01)。最高增殖抑制率为：应用400mg/L的EGCG处理Eca109细胞72小时后，其增殖抑制率达到74.28％。④FCM检测EGCG作用后细胞凋亡，用0、25、50、100mg/L的EGCG处理细胞，于24h、48h、72h收集细胞，用流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞凋亡率(apoptosis，AP)：24h组凋亡率分别为0.43±0.10％、6.01±0.67％、11.80±0.25％、16.54±0.84％；48 h组分别为0.59±0.12％、8.12±1.13％、13.99±0.90％、24.35±4.50％；72h组分别为0.88±0.19％、10.82±0.25％、20.84±1.71％、40.01±3.44％。实验组与对照组比较，均有显著性差异(P<0.01)。随着药物浓度、作用时间的增加，凋亡率逐渐增高，呈正相关关系，pearson关联性分析，剂量依赖(r=0.655，P<0.01)，时间依赖(r=0.567，P<0.01)。⑤用TRAP-PCR银染法检测每组细胞的端粒酶活性，在银染之后阳性结果为出四条以上的间隔6bp的条带。用药浓度相同时，25mg/L作用24h后，端粒酶活性表达为阳性，48h为弱阳性，72h后为阴性，随着作用时间的增加，端粒酶活性降低；作用时间相同时，24h后对照组(0mg/L)为强阳性表达，25mg/L，为阳性，50 mg/L为弱阳性，100mg/L端粒酶活性检测为阴性，随着用药浓度的增加，端粒酶活性降低。
　　结论：⑴端粒酶在食管癌组织中的阳性表达率显著高于食管不典型增生及正常组织，提示端粒酶的异常表达与食管癌的发生与发展有关。⑵食管癌组织中端粒酶的活性显著高于癌旁组织及正常组织，测定食管癌组织中端粒酶活性对食管癌诊断及预后判断有重要价值。⑶EGCG可通过下调端粒酶活性诱导Eca109细胞凋亡，这可能是茶叶中茶多酚抗肿瘤的重要机制之一。