促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)对人胶质瘤细胞株U87CRFR1表达的比较研究

摘要

促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-releasing factor,CRF)是一种重要的神经内分泌肽,主要生理作用是刺激腺垂体合成和分泌促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormon,ACTH)及其有关多肽。CRF及其肽家族共同调节机体在应激状态下丘脑—垂体—肾上腺(Hypothalamus-pituitary-adpenal axis,HPA)轴的功能,并且协调应激状态下内分泌系统、自主神经系统、免疫系统、生理学及行为学等功能,并对心血管、胃肠道、生殖、皮肤等有调节作用。CRF及其相关肽通过其受体(Corticotropin releasing factor receptor,CRFR)发挥作用。CRY受体属于G-蛋白偶联受体,通过腺苷酸环化酶的活化发挥作用。促肾上腺皮质激素释放激素受体1(Corticotropin releasing factor receptor1,CRFR1)是HPA轴中最主要的受体,主要介导经典的CRF促进垂体ACTH释放的作用,参与应激反应。而在人类中枢系统的一些恶性肿瘤组织中亦发现存在有CRFR1受体的过度表达。但在CRF及其受体与胶质瘤的研究中还未曾发现它们之间存在有某些确定的理论关系。
　　 目的:探讨人胶质瘤细胞株L187中CRFR1受体表达及其应用不同浓度CRF作用U87细胞后CRFR1受体的表达情况。
　　 方法:
　　 1从培养的U87细胞中提取总RNA(ribonucleic acid),设计CRFR1引物,进行RT-PCR扩增,凝胶电泳分析结果。
　　 2不同浓度CRY作用于胶质瘤细胞U87作用。将U87传代后随机分为四组,每组分别加入不同浓度的CRY(10-7,10-9,10-12mol/L)和不加CRF(对照组)的DMEM(含10％牛清+青链霉素)培养基,在有盖玻片的六孔培养板中继续培养U87细胞。培养12h后,每个浓度分别各取出两个孔中的细胞,进行细胞的免疫化学染色。剩余孔中细胞继续培养,在24h后以同样的方法再取出一批进行细胞免疫组化。最后一批于48h后取出行细胞免疫组化。实验重复三次。最后以细胞免疫组化结果中CRFR1表达的阳性率为结果进行统计学分析。
　　 结果:
　　 1 RT-PCR的结果显示人胶质瘤U87中存在CRFR1 mRNA表达。2.进行免疫细胞化学染色,结果显示所有组中均表达CRFR1阳性,阳性反应物位于胞浆,在细胞核周边呈现清晰淡黄色或棕黄色。以CRFR1表达的阳性率为统计数据:
　　 2.1采用单因素方差分析不同CRF浓度对CRFR1表达的影响,每个实验组和对照组相比较,经统计学处理结果如下:12h(F=8.099,P＜0.05):24h(F=51.665,P＜0.05):48h(F=14.531,P＜0.05)。可以认为不同CRF浓度对U87作用对CRFR1阳性表达率存在影响。在作用12或48h,CRF10-9 mol/L和其它各浓度组比较均有差别,而其它各浓度组间比较均无差别。在作用24小时,对照组和CRF10-9 mol/L比较有差别;对照组和CRF10-7mol/L,CRF10-12mol/L比较无差别;CRF10-7mol/L和CRF10-12mol/L组比较有差别。
　　 2.2采用单因素方差分析分析不同作用时间对CRFR1表达阳性率的影响,经统计学处理结果如下:CRF10-7mol/L作用不同的时间对CRFR1表达阳性率无影响(F=1.839,P=0.238);CRF10-12 mol/L作用不同的时间对CRFR1表达阳性率无影响(F=3.884,P=0.083);CRF10-9 mol/L作用不同的时间对CRFR1表达阳性率有影响(F=90.66,P=0.0001),不同时间的多重比较中任意两组比较均有差别。
　　 2.3对不同浓度CRF及其在不同的时间点相互交叉作用U87后CRFR1表达的阳性率数据进行析因分析;CRF不同的浓度对其CRFR1表达率有影响(F=21.185,P=0.0001);不同的作用时间点对CRFR1表达率也有影响(F=27.954,P=0.0001):并且不同的CRF浓度和不同的作用时间存在有交互作用(F=27.458,P=0.0001);不同CRF药物浓度及不同的时间,CRFR1表达阳性细胞百分率有所差异,在31%～93%之间。并且表达强度亦有差别。在CRF10-9 mol/L且24小时,结果显示为CRFR1表达阳性最强,呈棕褐色,并且表达阳性率最高,平均在87%左右。在CRF10-9 mol/L作用48小时,CRFR1表达阳性率也较高,平均在68%左右。
　　 结论:在RT-PCR结果中人胶质瘤U87中表达CRFR1mRNA。CRF作用于胶质瘤U87细胞后,其CRFR1受体表达的阳性细胞率在统计学上有意义。CRY的浓度及其作用时间均可影响其CRFR1受体细胞阳性率的表达,并且不同浓度和时间存在交互作用。在CRF为10-9mol/L作用24小时时,CRFR1阳性细胞表达率最高,染色更明显。在CRF10-9 mol/L时作用1587细胞,在24和48小时间上调了CRFR1受体的表达。但在其它浓度和时间点是这种现象则不明显,在CRF10-9mol/L时12小时表现为对CRFRl受体的下调。据我们的研究结果,推测CRF通过其受体CRFR1的表达对体外胶质瘤细胞的生长确实起到了一定影响的作用。