Nrf2在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中表达及莱菔硫烷保护作用机制研究

摘要

目的：多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病，目前其发病机制尚未完全明确，近年来许多研究表明，外源性与内源性亲电子物质所引起的氧化应激是多发性硬化脑损伤的重要机制之一。细胞内氧化物质具有氧化性，可导致细胞死亡，因此细胞启动抗氧化应激系统保护神经元。Nuclear factor-erythroid2 related factor2(Nrf2)为可与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合的转录因子，其结合后可启动内源性抗氧化系统产生多种抗氧化酶，从而抑制氧化应激所造成的损伤。莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)是一种异硫氰酸盐，以其前体萝卜甙形式广泛存在于十字花科植物中，多项研究证实，莱菔硫烷为Nrf2的重要激活剂，其可促进Nrf2核转位，与ARE结合，诱导Ⅱ相解毒酶表达产生抗氧化作用。由此可以推测，激活Nrf2/ARE通路可对EAE产生保护作用。莱菔硫烷对EAE的保护作用尚未有研究证明，莱菔硫烷诱导Nrf2核转位作用较强，副作用小，可透过血脑屏障，腹腔注射可被吸收，所以选择SFN进行试验，并与目前临床常用药物地塞米松(dexamethasone，DXM)比较以明确SFN是否具有保护作用及其强弱，以此证明SFN是否对MS有治疗价值。
　　本实验成功建立了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)模型，测定了不同时间点小鼠脑组织中Nrf2及丙二醛(MDA)的表达水平，应用莱菔硫烷与地塞米松干预，观察莱菔硫烷与地塞米松对神经功能缺损评分、Nrf2和MDA的表达的影响，探讨Nrf2和MDA的表达规律与莱菔硫烷对EAE的保护作用。
　　方法：
　　1动物分组：将120只8-10周雌性C57BL/6小鼠，体重18-20g，随机分为正常对照组，EAE组，莱菔硫烷组(50mg/kg)与地塞米松组(0.07mg/kg)：每组30只，每组又随机分为13天、20天、30天三个亚组，每个亚组10只小鼠。
　　2模型制备：将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成6mg/ml，并按1：1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/ml)混合，乳化后按每只0.1ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，免疫当天即第0h及第48h腹腔注射0.5mlPTX(1400ng/只)。免疫当天记为0天，免疫在乙醚麻醉及充分固定下进行。SFN组与DXM组在免疫后第一天起分别给予相应剂量的药物进行腹腔注射，药物隔日注射一次直至动物处死为止，正常对照组及EAE组小鼠给予等量的生理盐水隔日腹腔注射。分别在第13天，20天，30天将动物处死，留取脑组织与腰膨大，用免疫组织化学方法测定Nrf2在蛋白水平的动态表达。用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的动态表达。
　　3神经功能评分：于动物免疫当日及免疫后每日上午8:00时下午17：00时对动物体重、活动状况、精神状态、皮毛光泽度进行观察，并对动物进行神经功能评分，Benson评分标准：0分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分：双后肢无力，被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分：濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以土0.5计。
　　4脑组织Nrf2表达的测定：将实验小鼠于免疫后第13天、20天、30天时麻醉后4%多聚甲醛固定，甲醛固定好后取脑组织，于4%多聚甲醛中保存24小时，石蜡包埋，组织切片，应用SP法进行免疫组化，光学显微镜下观察阳性细胞，并计数。
　　5脑组织丙二醛的测定：将实验小鼠于免疫后第13天、20天、30天时麻醉后，立即断头在冰盘上快速取脑，剥除硬脑膜，去除小脑、脑干、额极及脑室周围皮层，在0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，准确称重，按1:9加入冰冷生理盐水制成组织匀浆液，然后在冰浴中超声400安培，5s/次，间隙10秒反复3～5次，2000r/min，4℃离心15min。取上清，置于-70℃冰箱中保存待测。
　　结果：
　　1动物发病率观察：EAE组、SFN组与DXM组小鼠发病率分别为：100%、33.33%、27.78%。EAE组小鼠的发病率高于SFN组与DXM组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　2行为学观察：EAE组、SFN组与DXM组小鼠在发病高峰期时神经功能评分均数分别为：2.38±0.52、1.33±0.50、1.25±0.50，EAE组小鼠神经功能评分明显高于SFN组与DXM组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　3精神状态与皮毛光泽度观察：EAE组小鼠精神萎靡皮毛黯淡偶有溃疡，SFN组小鼠精神正常皮毛光滑，DXM组小鼠精神兴奋皮毛暗淡有溃疡。
　　4脑组织中Nrf2表达：各组小鼠的Nrf2表达均较对照组上调，发病高峰期时空白对照组、EAE组、SFN组与DXM组Nrf2计数分别为：5.80±2.17、23.60±7.64、73.60±10.55、69.00±8.09。SFN组与DXM组表达与EAE组比较差异有统计学意义(P<0.05)5脑组织中MDA含量：空白对照组、EAE组、SFN组与DXM组小鼠在发病高峰期时含量分别为20.35±1.10、40.34±7.50、9.65±5.50与8.86±5.21，SFN组与DXM组小鼠MDA含量明显低于EAE组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1 EAE小鼠模型中Nrf2表达上调，但是SFN组与DXM组上调更明显。
　　2 SFN组可以降低EAE小鼠发病率，减轻发病时神经功能损伤程度。
　　3 SFN组可以通过上调Nrf2表达发挥抗氧化应激作用来减轻小鼠发病率。
　　4 SFN与DXM比较，虽然DXM在神经功能评分与发病率上优于SFN，但SFN不会引起精神改变与皮肤溃疡等长期应用DXM引起的严重不良反应，充分显示了耐受性良好与应用安全的优势。