替米沙坦对NAFLD大鼠肝脏及大网膜脂肪组织中PPARγ表达的影响

摘要

目的：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fat liver disease，NAFLD)是排除病毒，乙醇，化学物质，放射线及自身免疫性疾病等损肝因素所致的以肝细胞脂肪变性为主要病理改变的慢性肝脏疾病。其病理过程大致分为单纯性脂肪肝，脂肪性肝炎，脂肪性肝硬化3个类型。NAFLD与遗传、环境、代谢等因素有关，美国内分泌医师协会已将其列为代谢综合征(matebolic syndrome，MS)，的组成成分之一。近年来，随着生活方式和饮食结构的改变，NAFLD发病率有逐渐上升的趋势，目前已成为严重危害人类健康的肝脏疾病之一。NAFLD的发病机理目前存在“二次打击”学说：第一次打击涉及胰岛素抵抗，由于机体的自我防御机制，此阶段可有抗细胞凋亡通路的活化，脂联素、IL-6等抗炎因子的表达增加，因此病变存在可逆性；第二次打击主要是活性氧代谢产物的增加所致的脂质过氧化反应，ROS与生物膜的磷脂等多不饱和脂肪酸的侧链结合，导致生物膜的流动性改变，通透性增加，核酸、酶等大分子功能受损，使脂肪变性的肝细胞发生凋亡坏死。
　　作为NAFLD发病的中心环节，胰岛素抵抗已成为很多药物治疗该病的靶点。白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)是机体重要的内分泌器官，脂肪细胞因子水平(如IL-8，NGF)上升与代谢异常及胰岛素抵抗存在因果关系，并导致肝脏脂质蓄积。PPARγ是一种配体激活的核激素受体，在白色脂肪组织中高表达，具有调节脂肪酸代谢，诱导脂肪细胞分化的作用，在前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的演变过程中表达量逐渐增加，影响着脂肪细胞的生长发育和功能状态，进而影响白色脂肪组织的内分泌功能。适度抑制其表达可以起到减轻胰岛素抵抗的作用。解耦连蛋白2(uncoupling protein2，UCP2)属于解耦连蛋白家族，可以介导质子跃迁，使能量以热能的形式释放，减轻细胞氧化应激，在生热及能量代谢中意义重大。NAFLD时，UCP2表达量增加，是一种适应性反应。
　　替米沙坦，一种传统的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，不仅可以抑制AT1受体，还可作为PPARγ的部分激动剂，起到减轻胰岛素抵抗的作用。有研究证实替米沙坦可促进肝组织中PPARγ的表达，但在白色脂肪组织中起何种作用目前尚未有研究报道。本实验应用高脂饮食建立NAFLD胰岛素抵抗大鼠模型，观察观察替米沙坦干预前后血脂血糖，胰岛素敏感性，转氨酶的变化情况，并检测肝组织及大网膜组织PPARγ及肝组织中UCP2的表达变化，探讨替米沙坦治疗NAFLD的机制。
　　方法：
　　1.动物模型的制备：选取雄性(Sprague Dawley)SD大鼠，正常对照组喂饲普通饲料，高脂对照组饲以84％普通饲料+高脂饲料，配方为：1％胆固醇、5％蛋黄粉、10％猪油，实验动物自由进食及饮水。
　　2.实验分组：将SD大鼠40只随机分为正常对照组(NC group，n=15)、高脂对照组(FC group，n：15)，高脂+替米沙坦干预组(FT group，n=10)。饲养12周末时随机取NC及FC组各5只做高胰岛素正葡萄糖钳夹实验及肝组织的HE染色，确定造模成功。后FT组给予替米沙坦(5mg/kg.d)灌胃并予高脂饮食，正常及高脂对照组则以等容量的生理盐水灌服，每日一次，共持续4周。
　　3.大鼠体重、肝湿重和肝指数的变化：应用电子天平称取体重及肝湿重，并根据以下公式计算肝指数：肝湿重/体重×100％。
　　4.胰岛素敏感性测定：我们以高胰岛素正葡萄糖钳夹实验技术(euglycermic hyperinsulinemia clamp technique)在稳态时葡萄糖的输注速率(GIR)来评估胰岛素的敏感性。
　　5.肝组织学检查：应用石蜡切片，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色的方法，在光镜下观察肝脏病理学的变化情况。
　　6.大网膜组织中PPARγmRNA，肝组织中PPARγmRNA、AT1 mRNA及UCP2 mRNA表达：采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，平行观察肝组织/大网膜组织(WAT)PPARγmRNA含量变化及肝组织PPARγ、AT1、UCP2 mRNA的表达水平变化。采用磷钼酸比色法测定肝组织ATP含量。
　　7.血清生化学的检测：取血清样本，在河北医科大学第二医院生化室的协助下，应用全自动血清生化分析仪检测转氨酶及血脂等生化指标的变化。
　　结果：
　　1.各组大鼠的体重、肝湿重和肝指数的变化：在16周末成功的复制了大鼠NASH的模型。FC组的大鼠体重(597.51±15.62)、肝湿重(21.93±1.65)和肝指数(3.67±0.23％)均明显的高于NC组的体重(523.37±18.43)、肝湿重(12.39±0.96)和肝指数(2.37±0.17％)(P<0.01)，差异显著。而FT组的体重(559.65±15.80)、肝湿重(16.10±1.13)和肝指数(2.88±0.17％)均明显低于模型组(P<0.01)，有统计学意义。
　　2.关于胰岛素敏感性的变化：各组之间比较均有统计学意义，两两比较结果显示，NC组明显高于其它两组，而FT组高于FC组。
　　3.肝组织病理学的变化情况：NC组无肝细胞脂肪变性，且未见炎细胞浸润；而FC组出现了弥漫性的肝细胞脂肪变性，中央静脉周围最为显著，并可见程度不一的小叶内炎症和汇管区的炎症，点灶状坏死，部分坏死甚至融合成片，与正常对照组相比差异显著(P<0.01)。FT组肝细胞脂肪变性分级与FC组相比明显改善(P<0.05)，炎症分级与FC组相比明显的降低(P<0.05)。
　　4.血清生化指标的变化：(1)血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)：FC组ALT(97.57±9.02)较正常组(43.14±8.38)显著升高(P<0.01)，而FT组ALT(71.00±10.41)较FC组显著下降(P<0.01)，但与NC相比仍有差异(P<0.01)。FC组AST(221.00±26.52)较NC组(121.86±10.35)显著增高(P<0.01)，FT组AST(153.29±16.46)较FC组下降(P<0.01)。(2)血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)：FC血清TC、TG(1.41±0.17，0.73±0.17)较正常组(0.78±0.16，0.27±0.08)显著升高(P<0.01，0.01)，FT组TC、TG(1.22±0.24，0.60±0.13)较FC组下降，但无显著性差异(P>0.05)；FC组HDL-C(0.73±0.07)较NC组(0.92±0.05)显著下降(P<0.01)，而FT组HDL-C(0.79±0.04)较FC组有所上升，但无显著性差异(P>0.05)。(3)血糖：FC组空腹血糖(11.88±2.13)与NC组相EE(5.53±1.13)明显升高(P<0.01)，FT组空腹血糖(9.22±1.40)较FC组下降，有显著性差异(P<0.05)。
　　5.PPARγ、AT1R和UCP2 mRNA表达：(1)肝组织PPARγmRNA变化：与NC组mRNA(0.389±0.014)相比，FC组(0.167±0.015)显著降低(P<0.01)；FT组(0.308±0.018)较FC组明显升高(P<0.01)。(2)大网膜组织PPARγmRNA变化：与NC组mRNA(0.185±0.014)相比，FC组(0.476±0.082)显著升高(P<0.01)；FT组(0.291±0.010)较FC组明显降低(P<0.01)。(3)UCP2 mRNA变化：与NC组mRNA(0.198±0.016)相比，FC组(0.321±0.022)显著升高(P<0.01)；FT组(0.342±0.016)高于NC组，差别不具有显著性。(4)AT1R mRNA变化：与NC组mRNA(0.198±0.016)相比，FC组(0.321±0.022)显著升高(P<0.01)；FT组(0.342±0.016)较FC组升高，但无显著性差异(P值>0.05)。
　　6.肝组织ATP含量：FC组(3.54±0.81)较NC组(5.50±0.59)降低，具有显著性差异(P<0.01)；FT组(3.39±0.53)较FC组有降低趋势，但差别不具有显著性。
　　结论：16周高脂饲料饮食成功诱导了大鼠NASH模型，通过替米沙坦干预可以改善糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、降低体重并使肝脏脂肪变性炎症坏死减轻，血液中TC、TG降低，认为替米沙坦对大鼠NASH和IR可起到有效的治疗作用。其分子机制可能与其部分激动PPARγ受体，特异性结合AT1受体有关。