胡椒碱对脊髓损伤大鼠神经保护及作用机制实验研究

摘要

背景:脊髓损伤是神经外科常见疾病之一,虽经国内外多年研究,目前尚无理想恢复神经功能的方法。依据目前对脊髓损伤病理发展过程的新认识及胡椒碱药理作用的研究,我们设计本研究以观察胡椒碱是否具有对脊髓损伤神经功能保护作用,并对可能的作用机制做进一步的探讨。以求保护脊髓损伤后的神经功能的新方法。
　　 第一部分胡椒碱对脊髓损伤大鼠运动功能保护作用的观察
　　 目的:观察胡椒碱是否具有对脊髓损伤大鼠运动功能保护作用。
　　 方法:(1)动物来源与分组:将36只成年雄性SD大鼠应用随机数字表进行随机分组,分为4组,每组9只,分为假手术组,生理盐水组,胡椒碱溶媒组,胡椒碱组。(2)大鼠脊髓损伤动物模型制作:所有组的大鼠均在胸10左右水平打开背侧脊柱棘突,生理盐水组,胡椒碱溶媒组,胡椒碱组按照Allen's法建立脊髓损伤模型,假手术组不进行脊髓损伤。(3)给药方式:胡椒碱组大鼠进行50mg/kg胡椒碱悬浊液(含7ml/kg胡椒碱溶媒)灌胃给药,胡椒碱溶媒组大鼠只给予7ml/kg胡椒碱溶媒(含灭菌注射用水、无水乙醇和聚乙二醇-400混合液)灌胃给药,假手术组和生理盐水组大鼠给予7ml/kg生理盐水灌胃给药。每组大鼠都是在术后1d给予灌胃给药,每天一次,持续14d。(4)大鼠脊髓神经功能测定:受试大鼠分别在术后1d、7d、14d应用国际通用的BBB行为学评分法(Basso-Beattie-BresnahanTest)进行评价。模型各组术后1d评分为0分则纳入实验。在7d和14d时进行各组进行比较。术后14d受试动物麻醉后经左心室灌注4％多聚甲醛磷酸缓冲液,取损伤部位5mm脊髓,用4%多聚甲醛液固定48小时,常规石蜡包埋。(5)数据统计:本实验数据应用SPSS13.0统计分析,数据均为统计计量资料,符合正态的数据用-x±S(均数±标准差)表示,否则用中位数表示。多个样本均数比较,若数据符合正态性分布且方差齐则采用one-way ANOVA(F检验),组间两两比较采用LSD-t检验,否则采用秩转换的非参数检验的Mann-Whitney U法。定P＜0.05为有显著性差异。
　　 结果:
　　 1术后1d假手术组大鼠术后没有截瘫(21分),术后7d、术后14d的评分分别为(21,21)。术后1d其他组大鼠术后均出现截瘫(0分),胡椒碱组大鼠术后7d、14d的评分分别为(6.33±1.58,11.00±0.87)。胡椒碱溶媒组大鼠术后7d、14d的评分分别为(2.89±0.78,6.78±1.09)。生理盐水组大鼠术后7d、14d的评分分别为(3.00±1.32,6.44±1.24)。除了假手术组,其它各组术后14天较7天评分均有所恢复。
　　 2术后7d,假手术组的评分分别与胡椒碱组(Z=-3.841,P=0.000)、胡椒碱溶媒组(Z=-3.855,P=0.000)和生理盐水组(Z=-3.839,P=0.000)比较均有显著性差异。术后14d,假手术组的评分分别与胡椒碱组(Z=-3.848,P=0.000)、胡椒碱溶媒组(Z=-3.841,P=0.000)和生理盐水组(Z=-3.848,P=0.000)比较均有显著性差异。术后7d以及术后14d胡椒碱溶媒组和生理盐水组之间比较均没有显著性差异(Z=-0.184 P=0.854,Z=-0.509 P=0.611),术后7d胡椒碱组分别与胡椒碱溶媒组和生理盐水组之间比较有显著性的差异(Z=-3.485 P=0.000,Z=-3.621 P=0.000),术后14d胡椒碱组分别与胡椒碱溶媒组和生理盐水组之间比较有显著性的差异(Z=-3.621 P=0.000,Z=-3.616.P=0.000)。
　　 结论:胡椒碱具有促进脊髓损伤大鼠运动神经功能恢复的药理作用。
　　 第二部分胡椒碱促进脊髓损伤大鼠运动神经功能恢复作用机理研究
　　 目的:探讨胡椒碱促进脊髓损伤大鼠运动神经功能恢复作用机理。
　　 方法:(1)动物来源与分组、大鼠脊髓损伤动物模型制作、给药方式、大鼠脊髓神经功能测定和数据统计同第一部分。于术后7d留取脊髓损伤部位标本(同第一部分)。模型各组术后1d评分为0分则纳入实验。术后7d脊髓组织和术后14d脊髓组织(第一部分留取)分别行HE染色以观察脊髓损伤后的病理变化,原位末端标记法(TUNEL染色)检测脊髓神经细胞凋亡变化,免疫组织化学染色法检测caspase-3蛋白表达变化。
　　 结果:
　　 1 HE染色观察脊髓组织病理改变
　　 假手术组脊髓组织完整,细胞排列整齐,未见明显坏死及空洞。生理盐水组、胡椒碱溶媒组和胡椒碱组中,术后7d各组均有不同程度的组织破坏,并有出血、水肿和空洞。胡椒碱组脊髓组织较连续。术后14d各组明显恢复,胡椒碱组分别与生理盐水组和胡椒碱溶媒组比较,组织较连续,水肿明显减轻,仅有轻度的空泡样变化。
　　 2 TUNEL法测凋亡细胞
　　 2.1 TUNEL法染色阳性的细胞在大鼠脊髓损伤严重的区域表达较多。假手术组术后7d、14d的脊髓组织中表达极少的阳性细胞,分别为(7.54±2.51,6.27±2.27)个,胡椒碱组、胡椒碱溶媒组和生理盐水组中术后7d分别为(29.80±6.30,42.58±10.46,41.50±7.97)个,术后14d分别为(20.32±6.64,30.71±7.10,33.59±6.04)个。
　　 2.2术后7d,假手术组的阳性细胞数分别与胡椒碱组(Z=-3.576,P=0.000)、胡椒碱溶媒组(Z=-3.576,P=0.000)和生理盐水组(Z=-3.576,P=0.000)比较均有显著性差异。术后14d,假手术组的评分分别与胡椒碱组(Z=-3.576,P=0.000)、胡椒碱溶媒组(Z=-3.576,P=0.000)和生理盐水组(Z=-3.576,P=0.000)比较均有显著性差异。生理盐水组与胡椒碱溶媒组术后7d、14d比较均无显著性差异(Z=-0.486,P=0.627,Z=-0.927,P=0.354)。胡椒碱组中凋亡阳性细胞数分别与胡椒碱溶媒组和生理盐水组比较,术后7d有显著性差异(Z=-2.517,P=0.012,Z=-2.958,P=0.003),术后14d有显著性差异(Z=-2.693,P=0.007 Z=-3.223,P=0.001)。
　　 3 Caspase-3阳性表达观察
　　 3.1在大鼠的脊髓损伤的区域Caspase-3蛋白阳性表达较多。假手术组的术后7d、14d的脊髓组织中极少发现Caspase-3蛋白阳性表达,平均光度值分别为(0.1323±0.0149,0.1371±0.0122),胡椒碱组、胡椒碱溶媒组和生理盐水组中术后7d平均光度值分别为(0.2824±0.0464,0.3452±0.0497,0.3411±0.0449),术后14d分别为(0.1936±0.0378,0.2551±0.0367,02456±0.0262)。
　　 3.2术后7d,假手术组的平均光度值分别与胡椒碱组(P=0.000)、胡椒碱溶媒N(P=0.000)和生理盐水组(P=0.000)比较均有显著性差异。术后14d,假手术组的评分分别与胡椒碱组(P=0.000)、胡椒碱溶媒组(P=0.000)和生理盐水组(P=0.000)比较均有显著性差异。生理盐水组与胡椒碱溶媒组术后7d、14d比较均无显著性差异(P=0.835,P=0.505)。胡椒碱组分别与胡椒碱溶媒组和生理盐水组比较,术后7d有显著性差异(P=0.003,P=0.005),胡椒碱组分别与胡椒碱溶媒组和生理盐水组比较,术后14d有显著性差异(P=0.000,P=0.001)。
　　 结论:胡椒碱的能够减少大鼠脊髓损伤部位的神经细胞凋亡,其机制可能与抑制大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3蛋白表达有关。