阿霉素肾病大鼠足细胞nephrin、ZO-1、podoplanin的表达变化及舒洛地特对其干预作用的研究

摘要

目的：肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是临床上常见的肾小球疾病之一，其典型表现为大量蛋白尿(≥3.5g/d)、低白蛋白血症(血浆白蛋白<30g/L)、水肿、高脂血症。持续性的大量蛋白尿会造成肾小球高滤过状态，甚至导致肾脏的不可逆损伤，从而严重影响人们的生活质量，给人们带来严重的经济负担和心理负担。因此，如何更好的治疗肾病综合征、缓解蛋白尿是目前临床上学者们密切关注的课题之一。
　　阿霉素肾病(Adriamycin nephropathy，ADN)模型是一种已经被广泛的研究的动物模型，它的临床表现与人类的肾病综合征类似，根据其给药方式和病理表现，可分为急性阿霉素肾病模型和慢性阿霉素肾病模型，第1周到第4周为急性阿霉素肾病模型，病理改变与人的微小病变肾病(Minimal change disease，MCD)相似，第5周到第12周为慢性阿霉素肾病模型，病理改变与人的局灶节段性肾小球硬化(Focal segmentalglomerulosclerosis，FSGS)相似。大量研究表明，产生蛋白尿的主要原因之一是肾小球滤过屏障的变化，特别是足细胞的结构及相关分子的改变，其中足细胞相关分子包括nephrin、ZO-1、podoplanin等。而舒洛地特是一种新型天然糖胺聚糖、类肝素，由猪肠黏膜提取精制。舒洛地特含有低分子肝素和硫酸皮肤素两个主要成分，由于作用原理不同而协同增效。肾病状态时，舒洛地特可以通过保存肾小球的正常负电荷，并抑制细胞的增殖及肾小球滤过屏障的病变，达到降低尿蛋白的排泄率的目的。
　　本课题拟通过尾静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，结合透射电镜、免疫组化、逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)等检测手段，观察阿霉素肾病大鼠足细胞nephrin、ZO-1、podoplanin的表达变化，并探讨舒洛地特对其表达的干预作用及作用机制。
　　方法：60只健康清洁级12周龄雄性SD大鼠适应性喂养1周后，随机抽取48只大鼠通过单次尾静脉注射阿霉素(6.5mg/kg)建立阿霉素肾病大鼠模型，2周后测量大鼠的24小时尿蛋白定量，如果大于100mg/d则认为是造模成功。造模成功后随机分为阿霉素肾病组(M组)、泼尼松组(P组)、舒洛地特组(S组)、泼尼松+舒洛地特组(P+S组)，将剩余的12只大鼠作为正常对照组(N组)。S组每天给予10mg·kg-1·d-1舒洛地特灌胃，P组每天给予7.5mg·kg-1·d-1泼尼松灌胃，P+S组每天给予泼尼松7.5mg·kg-1·d-1+舒洛地特10mg·kg-1·d-1灌胃，N组及M组每天以等量生理盐水灌胃，并于应用药物干预后4、8周末测定大鼠24h尿蛋白定量、血白蛋白、血肌酐、血尿素氮、血胆固醇、血甘油三酯，并应用免疫组化、RT-PCR等方法观察阿霉素肾病发展过程中足细胞nephrin、ZO-1、podoplanin的表达变化，于8周末应用透射电镜观察阿霉素肾病大鼠肾脏病理改变。所得结果均用均数±标准差(x-±s)表示，所有数据应用SPSS17.0软件包进行统计学处理，组间差异性比较采用单因素方差分析，其中方差不齐时选用Tamhane’s检验，P<0.05被认为有统计学意义。
　　结果：
　　1.实验4周末，M组大鼠24h尿蛋白定量、血胆固醇、血甘油三酯较N组明显增加(P<0.05)，血白蛋白较N组下降(P<0.05)，且P、S、P+S组和M组的差异有统计学意义(P<0.05)。8周末，P、S、P+S组大鼠的24h尿蛋白定量、血胆固醇、血甘油三酯、白蛋白和M组相比，它们之间的差异更显著(P<0.05)，其中P+S组变化最为明显(P<0.05)。4周末，N、M、P、S、P+S这5组大鼠的血肌酐、尿素氮相比无明显差异(P>0.05)，而在8周末，M组大鼠的血肌酐、尿素氮较N组有所增加(P<0.05)，且P、S、P+S组大鼠的血肌酐、尿素氮较M组有所下降(P<0.05)。
　　2.免疫组化和RT-PCR结果显示4周末，M组大鼠nephrin、ZO-1、podoplanin的表达较N组有所减少(P<0.05)，P、S、P+S组大鼠nephrin、ZO-1、podoplanin的表达较M组有所增加(P<0.05)，且P+S组变化最为明显(P<0.05)。8周末，M组大鼠nephrin、ZO-1、podoplanin的表达较N组减少更加明显(P<0.05)，P、S、P+S组较M组表达有所恢复(P<0.05)，且P+S组恢复最为明显(P<0.05)。
　　3.透射电镜结果显示8周末N组大鼠的肾小球结构正常，M组大鼠的肾小球出现足突融合、基底膜增厚、内皮细胞肿胀等表现，P组、S组、P+S组大鼠的病变较M组减轻，P+S组病变最轻。
　　结论：
　　1.在阿霉素肾病发展过程中，nephrin、ZO-1、podoplanin的表达逐渐减少，且与蛋白尿、肾功能受损程度一致，提示它们的减少可能是阿霉素肾病大鼠蛋白尿的产生机制之一。
　　2.舒洛地特对阿霉素肾病大鼠具有降低尿蛋白、保护肾脏的作用，并可以在一定程度上恢复nephrin、ZO-1、podoplanin的表达，提示其作用机制可能与其可以上调nephrin、ZO-1、podoplanin的表达有关。
　　3.舒洛地特与泼尼松合用时，对阿霉素肾病大鼠降低尿蛋白、保护肾脏的作用最明显，且对nephrin、ZO-1、podoplanin表达的改善作用也最明显，提示舒洛地特与泼尼松在降低尿蛋白、保护肾脏方面具有协同作用。