Raf激酶抑制蛋白对HCCLM3肝癌细胞乙酰肝素酶表达的抑制作用及其机制

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在世界上最常见的恶性肿瘤中位于第五位，在导致肿瘤的死亡原因中位于第三位，肝细胞癌是我国最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，其特点是有易复发、转移、预后差及病死率高。肝细胞癌易侵袭和转移导致了其预后差及病死率高。因为恶性肿瘤侵袭和转移及其调控的分子机制是一个复杂的过程，目前对这个过程的研究仍然不是非常清楚，所以在临床治疗肝细胞癌的理论上我们仍然不能提供明确的指导方向，因此，如果要提高临床上恶性肿瘤的治疗效果，必须明确恶性肿瘤侵袭转移及其调控的分子机制，目前，分子肿瘤学等基础理论学科的主要研究方向也是围绕恶性肿瘤的侵袭和转移及分子机制来进行的。
　　乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是一种葡萄糖醛酸内切酶，对肿瘤的发展、转移和肿瘤血管生成具有重要作用。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinaseinhibitor protein，RKIP)是高度保守的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(ohosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)家族中的一员，广泛存在于各种生物中。在调控信号传导通路的因素中，RKIP发挥了重要的作用，可以抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信号转导通路，在细胞生长、增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥重要的作用。已有的研究表明RKIP在恶性肿瘤侵袭和转移的过程中发挥了重要的作用，但在肝癌细胞中RKIP及Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路的具体作用及其确切机制，目前尚不清楚。
　　本研究首先观察RKIP基因稳定转染体外培养的肝癌细胞，检测RKIP作用后，Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路相关蛋白的表达和Hpa的表达情况，了解RKIP在肝癌细胞中的作用机制，其次在肝癌细胞中加入Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路激活剂EGF后，检测Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路相关蛋白的表达和Hpa的表达情况，进一步明确RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关。
　　目的：以HCCLM3肝癌细胞、空载体转染的HCCLM3肝癌细胞和稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞为研究对象，检测肝癌细胞中RKIP、Hpa、P-ERK的表达情况，进一步明确RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关。
　　方法：1.空载体转染的HCCLM3肝癌细胞、稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞，提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Western bloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，观察P-ERK、Hpa的表达是否与RKIP的表达有关。
　　2. HCCLM3肝癌细胞、经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞，提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Western bloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，观察RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达是否与Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路有关。
　　3. HCCLM3肝癌细胞、经稳定转染RKIP基因的HCCLM3肝癌细胞加入EGF，激活ERK通路，15分钟后提取细胞蛋白，BCA法蛋白定量。Western bloting检测RKIP、P-ERK和Hpa蛋白表达，进一步验证RKIP抑制肝癌细胞Hpa的表达与抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信号转导通路活化有关。
　　结果：1. RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空载体转染组(P<0.05)，而P-ERK和Hpa的表达明显低于空载体转染组(P<0.05)；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，P-ERK、Hpa的表达下降。
　　2. RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP的表达明显高于空白对照组(P<0.05)，而P-ERK和Hpa的表达明显低于空白对照组(P<0.05)；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，P-ERK、Hpa的表达下降。
　　3. EGF(+)对照组HCCLM3细胞中P-ERK的表达明显高于EGF(+)RKIP转染组(P<0.05)，EGF(+)对照组HCCLM3细胞中Hpa的表达明显高于EGF(+)RKIP转染组(P<0.05)；随着HCCLM3细胞中RKIP的表达升高，ERK通路激活后，P-ERK、Hpa的表达仍下降。
　　结论：1.在空载体转染的HCCLM3细胞中RKIP低表达，而P-ERK、Hpa高表达，在RKIP转染的HCCLM3细胞中RKIP高表达，而P-ERK、Hpa低表达，说明RKIP基因转染HCCLM3细胞成功。
　　2.在HCCLM3细胞中RKIP低表达，而P-ERK、Hpa高表达，而在RKIP转染的HCCLM3细胞中RKIP高表达，而P-ERK、Hpa低表达，说明在肝癌细胞中RKIP可能是通过ERK通路来抑制Hpa的表达。
　　3.在EGF(+)对照组HCCLM3细胞中RKIP低表达，P-ERK、Hpa高表达，而在EGF(+)RKIP转染组HCCLM3细胞中RKIP高表达，而P-ERK、Hpa低表达，说明在肝癌细胞中RKIP的表达抑制Hpa的表达与抑制ERK信号通路的活化有关。