氯胺酮对7日龄SD大鼠海马神经细胞毒性的作用机制

摘要

目的：探讨常用临床麻醉药氯胺酮对七日龄SD幼鼠海马神经细胞凋亡的影响以及氯胺酮注射后海马神经细胞中PKCγ、(ERK)1/2和Bcl-2的蛋白表达情况，在大脑快速发育时期给予氯胺酮，SD幼鼠成年后记忆行为能力上的缺失。
　　方法：
　　1.实验动物分组及模型制备7日龄SD大鼠96只(河北医科大学实验动物中心提供)生后7天的SD幼鼠(P7)，16.8±2.5mg，随机分为4组，每组24只，c组(对照组)腹腔注射生理盐水50 ml/kg，k1组腹腔注射氯胺酮25mg/kg，k2组腹腔注射氯胺酮50mg/kg，k3组腹腔注射氯胺酮75mg/kg，每日1次，连续3天，1.末次注射24h后各组随机选取5只腹腔注射4%戊巴比妥钠(25mg/Kg)麻醉，4%多聚甲醛灌注断头取脑，用TUNEL法(原位末端标记法)检测海马神经细胞凋亡率。2.c组，k1组，k2组，k3组随机取5只SD幼鼠断头取脑，用Western-blot法(免疫印迹法)检测海马神经细胞中PKCγ，ERK和Bcl-2的蛋白表达情况。3.c组，k1组，k2组，k3组SD幼鼠每组取14只饲养至60天的时候用Morris水迷宫测试SD大鼠空间学习记忆能力。
　　2.标本的采集处理及检测方法
　　2.1 TUNEL法检测海马神经细胞凋亡率。
　　c组，k1组，k2组，k3组，末次腹腔注射24h后各组选取5只腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉，固定在动物解剖台上，剪开胸腔，从心尖处插入圆头针，同时从右心耳处剪开心脏放血，幼鼠在同时间点先后灌注0.9%生理盐水200ml冲洗和4%多聚甲醛磷酸缓冲液250ml固定。注射完毕后立即断头，把幼鼠大脑从头颅中取出浸泡在福尔马林溶液中，之后取出双侧海马，4%的多聚甲醛后固定，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸腊，包埋，选取双侧海马互包平面行连续冠状切片，片厚4μm，CA1，CA2，CA3以及齿状回区连续切片备用。用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡率。
　　2.2 Western-blot实验检测海马细胞蛋白表达情况c组，k1组，k2组，k3组末次腹腔注射24h后各组选取5只SD幼鼠断头取脑，把大脑放置在冰上分离海马组织，然后把海马放在缓冲液里放置在冰上磨成匀浆，离心机上4℃15000r/min离心30min，取上清。Western-blot实验检测在发育中SD大鼠反复使用氯胺酮后海马神经细胞中PKCγ，ERK和Bcl-2的表达情况。证实氯胺酮是否通过PKCγ-ERK信号通路诱导海马神经细胞凋亡的。
　　2.3 Morris水迷宫测试了解SD鼠远期空间学习记忆能力。
　　c组，k1组，k2组，k3组SD鼠饲养至60天的时候通过Morris水迷宫测试，了解SD鼠快速发育期时反复使用氯胺酮对远期学习记忆力影响，SD鼠训练5天，每天训练2次，SD鼠从下水时开始到找到平台的时间记录为潜伏期，中间游泳的过程记录为距离，这些被录像机记录在电脑上，每天测试的平均数用统计学软件分析，训练结束后，SD鼠被放在撤去平台的水迷宫中，这些SD鼠在水迷宫中游120s，同时记录穿越平台的潜伏期、穿越平台的次数以及穿越靶目标象限的率。
　　计量资料用均数±标准差(χ-±s)表示，采用SPSS16.0进行统计学处理，正态性检验后做方差齐性检验，方差齐的组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差不齐的组间比较采用多个独立样本的秩和检验。p<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.TUNEL法检测结果与对照组(c组)比较，低剂量氯胺酮组(k1组)的凋亡细胞数增多但无统计学意义(P>0.05)，高剂量氯胺酮组(k3组)的凋亡细胞数则呈显著增加(P<0.05)。TUNEL染色后来记录各剂量组c组(对照组)，k1组，k2组，k3组，海马区域CA1，CA2，CA3以及齿状回的凋亡细胞个数，我们可以了解到在高剂量氯胺酮组(k3组)的CA1和齿状回区凋亡细胞个数(47.10±9.31 and39.40±9.82)/mm2远远高于对照组(25.70±5.75and27.30±5.37)/mm2(P<0.01)。
　　2.western blotting实验证实氯胺酮通过PKCγ-ERK信号通路诱导细胞凋亡。检测c组(对照组)，k1组，k2组，k3组p-PKCγ，t-PKCγ，p-ERK1/2，t-ERK1/2 Bcl-2蛋白表达情况。k1组，k2组，k3组比c组(对照组)，抑制PKCγ和ERK1/2的磷酸化和Bcl-2的表达，但是k1组，k2组，k3组相比c组，t-PKCγ和t-ERK蛋白表达水平没有变化。k2组，k3组与c组比较Bcl-2基因蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)k2组，k3组与c组比较p-ERK1/2基因蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。
　　3.SD鼠饲养至60天时Morris水迷宫检测，c组，k1组，k2组，k3组通过Morris水迷宫5天的训练。在第4天和第5天高剂量氯胺酮组(k3组)在找寻隐藏平台潜伏期比对照组(c组)明显增加，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。在第4天和第5天的训练过程中高剂量氯胺酮组(k3组)比对照组(c组)在找平台时的距离明显增长，差异显示有统计(P<0.01，P<0.01)。在120s探测试验中，k2组、k3组比c组在找平台时的潜伏期增加，差异有统计学差异(P<0.01)，高剂量氯胺酮组(k3组)穿越平台的次数远远少于对照组(c组)，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量氯胺酮组(k3组)在靶象限时间远远少于对照组(c组)，比较差异有统计学意义(P<0.01)。
　　结论：本实验通过连续三天反复给予7日龄SD鼠大剂量氯胺酮，成功制造出在快速发育期大剂量反复使用氯胺酮的实验动物模型。7日龄SD鼠大剂量反复使用氯胺酮，用TUNEL法检测出海马神经细胞的大量凋亡。高剂量氯胺酮通过PKCγ-ERK信号通路导致海马细胞的凋亡并且使成年后SD大鼠学习记忆能力的永久缺失。