基于双荧光素酶报告基因检测环境致癌物DNA损伤修复作用

摘要

目的:随着工农业的发展，越来越多的化合物投入生产。如此众多的化学物质中，致癌化学物质占有相当的比例。近年来，我国肿瘤发病率升高明显，显然与环境致癌物的污染有关。在基因组的遗传稳定中，DNA损伤与修复具有十分重要的地位，因此对DNA损伤修复的检测也已经成为遗传毒物对生物体早期损伤的生物标记。目前已有多种不同的检测方法应用于环境致癌物对DNA损伤或修复的检测。常用检测DNA损伤的实验有微核实验、染色体畸变和彗星实验等。最近报道，可利用诱导基因结合灵敏的报告基因检测DNA损伤，常用的诱导基因有RAD51，RAD54和gadd153等。检测DNA修复的方法主要有彗星实验和宿主细胞恢复活性实验(HCR)。HCR是一种细胞内转染受损质粒，检测受损质粒的修复情况，以反应细胞对DNA的修复能力。然而上述检测方法均为分别检测DNA损伤或DNA修复作用。由于DNA受到损伤的同时可即刻启动细胞修复系统进行修复，所以仅仅单独检测DNA损伤或者修复能力并不能准确评价外来化学物质对细胞DNA的损伤作用。为系统评价环境致癌物对DNA的损伤和修复作用，本研究利用诱导基因GADD153-LUC检测方法结合HCR检测原理建立一种可同时检测外源化学物质对DNA损伤和修复作用的方法。
　　 方法:
　　 1细胞培养
　　 人肝母细胞瘤细胞株HepG2(中国武汉典型培养物保藏中心)于含10％热灭活小牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度下培养。利用RNA干扰技术，建立XRCC1低表达细胞株，于10％热灭活小牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度下培养。选对数生长期的细胞进行实验。
　　 2载体构建及转染
　　 pGadd153-LUC质粒是一种包括gadd153启动子和荧光素酶报告基因的载体，本实验室已构建成功。pRL-TK质粒是一种包含SV40启动子和海肾荧光素酶报告基因的载体，购买于Clontech公司。取对数生长期的HepG2细胞，用胰酶消化后轻柔吹打制成单细胞悬液，并计数。按2×105个/ml接种细胞于6孔培养板，于含10％FCS血清的DMEM培养基培养过夜，待细胞汇合度达95％时，脂质体转染法转染细胞。
　　 3宿主细胞恢复活性实验(HCR)
　　 氯化镉损伤质粒pRL-TK，乙醇沉降法回收受损质粒，TE溶解沉淀，质粒浓度定容为1μg/μl。瞬时转染受损质粒和pGL3-LUC质粒，不同致癌物染毒12小时后，检测荧光强度，同时检测样品蛋白含量，以荧光强度/μg蛋白含量，来反应DNA修复能力。
　　 4双荧光素酶报告基因检测
　　 受损质粒和pGadd153-LUC共转染HepG2细胞，转染后以不同化学物质对细胞进行染毒，12小时后收获细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测样品中双荧光素酶的表达情况。检测样品蛋白含量，以荧光强度/μg蛋白含量分别表示虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达量。
　　 5彗星实验
　　 彗星实验是一种传统的DNA损伤修复的检测方法。本研究分别比较彗星实验与Gadd153-Luc检测方法及HCR实验的检测灵敏度。
　　 6土壤中非挥发性有机化合物的检测
　　 土壤样品分别采集于3个不同污染程度的电子垃圾污染区（居民区，垃圾焚烧厂，农田），有机溶剂抽提法抽提土壤样品中非挥发性的有机物。以双荧光素酶报告基因检测法和彗星实验检测提取物对HepG2细胞DNA的损伤与修复作用。
　　 结果:
　　 1宿主细胞恢复活性实验最佳实验条件的选择
　　 氯化镉处理质粒的剂量与荧光素酶表达以及质粒受损的时间和荧光素酶表达的结果显示，5μmol/L氯化镉处理pRL-TK质粒2小时后转染HepG2细胞可使约90％的DNA损伤修复。相同剂量和时间处理质粒转染修复基因缺陷的细胞XRCC1(-)细胞，仅有60％的损伤可被修复。因此，本研究选择5μmol/L氯化镉处理PRL-TK质粒2小时后转染细胞进行DNA修复能力的检测。
　　 2宿主细胞恢复活性实验检测已知环境致癌物对HepG2细胞DNA修复能力的影响
　　 宿主细胞恢复活性试验检测7种已知环境致癌物对HepG2细胞DNA修复能力的影响，并与彗星实验结果进行比较。结果显示，HCR对其中5种环境致癌物影响DNA修复能力的检测限值要低于彗星实验的检测限值。其中对于苯并芘，HCR的检测限值比彗星实验低1000倍，对于氯化镉，HCR的检测限值比彗星实验低10倍。
　　 3双荧光素酶报告基因系统检测环境致癌物的DNA损伤修复能力
　　 双荧光素酶报告基因检测系统检测16种已知环境致癌物对DNA损伤与修复能力的影响。海肾荧光素酶的表达情况反应细胞对DNA的修复能力，虫荧光素酶的表达情况反应DNA的损伤情况。结果显示，16种有遗传毒性的环境致癌物，双荧光素酶报告基因的检测限值与单独gadd153-LUC检测系统或者HCR的检测限值，基本相同。本研究选择3种无遗传毒性的化学物质，利用双荧光素酶系统进行检测，均未见DNA损伤作用和对DNA修复能力的影响。
　　 4双荧光素酶报告基因系统检测土壤中非挥发性有机物提取物对HepG2细胞DNA损伤和修复的作用
　　 来自三个不同污染区的土壤中非挥发性有机提取物均可诱导虫荧光素酶报告基因的表达，说明该土壤中非挥发性有机物可诱导DNA损伤，强度为居民区＞垃圾焚烧厂＞农田土壤;同时该有机提取物可降低海肾荧光素酶报告基因的表达，说明土壤中非挥发性有机物具有降低DNA修复能力的作用，强度为居民区＜垃圾焚烧厂＜农田土壤。彗星实验检测土壤中非挥发性有机提取物对DNA的损伤情况。彗星实验的结果与双荧光素酶报告基因检测系统的检测结果一致。
　　 结论:
　　 1本研究建立了可同时检测环境致癌物对DNA损伤与修复能力的双荧光素酶报告基因检测系统。
　　 2环境致癌物对DNA的损伤修复情况，可以通过检测虫荧光素酶的表达活性来反应细胞DNA受损的程度，检测海肾荧光素酶的表达活性来反映DNA的修复水平。
　　 3应用重组细胞系统对多种致癌物和环境样品进行DNA损伤与修复能力的检测，本研究结果表明该检测系统对大部分致癌物质和实际环境样品均有较高的检测灵敏性。

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参考文献

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