siRNA抑制ZNF139前后胃癌BGC823细胞差异蛋白质的筛选与鉴定

摘要

目的:胃癌是全球第二大癌症致死性疾病，尤以中国等其他东亚国家高发。尽管世界各国的学者在对胃癌的发生发展和诊断治疗的研究中，已经发现许多胃癌相关基因和蛋白，但是仍然没有全面的揭示胃黏膜细胞的恶化、增殖凋亡、侵袭转移等机制。有研究表明，人锌指蛋白(zincfingerprotein，ZNF)家族基因在多种肿瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌等的发生和肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及多药耐药有关。锌指蛋白139(zincfingerprotein139，ZNF139)基因编码表达锌指蛋白亚科KRAB的转录调节蛋白，该蛋白含有重复的与保守序列相连接的Cys2-His2(C2H2)锌指结构域，而这种结构被认为与特异的DNA调控基因的转录、参与RNA转录后调控、介导蛋白质间相互作用。本实验室前期研究发现ZNF139的异常表达与胃癌的分化密切相关，但ZNF139与胃癌的发生发展的具体机制之间的关系尚不清楚。本实验用ZNF139特异性siRNA转染人胃癌细胞株BGC823，研究被抑制后ZNF139基因mRNA的表达，并依靠蛋白质组学技术进一步探讨ZNF139基因被抑制前后胃癌细胞差异表达的蛋白质及其生物学功能。
　　 方法:
　　 1.用含有ZNF139特异性siRNA的质粒转染胃癌细胞BGC823抑制ZNF139基因的表达，应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测转染前后BGC823细胞内ZNF139mRNA表达变化情况。
　　 2.培养胃癌细胞株BGC823，通过siRNA转染胃癌细胞抑制ZNF139基因的表达，应用双向差异凝胶电泳分离、筛选转染前后BGC823细胞内差异表达的蛋白质，然后用液相质谱—色谱技术鉴定并用生物信息数据库分类相关蛋白质。
　　 3.采用蛋白质印迹技术（Westernblot）验证鉴定出的蛋白质在转染前后胃癌细胞中表达量与蛋白质组学方法结果是否一致。
　　 结果:
　　 1.siRNA抑制ZNF139前后胃癌细胞ZNF139mRNA表达发现:阳性组的ZNF139mRNA的相对表达量(15.6±1.61)×10-5显著低于空白对照组（68.8×±4.05）×10-5，且二者之间差异有统计学意义(P=9.1×10-10＜0.05);空白对照组与阴性对照组ZNF139mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P=0.491＞0.05)。
　　 2.胃癌细胞双向差异凝胶电泳图谱中差异蛋白质点的分析:应用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware选取了8个具有显著表达差异的蛋白质点，并用Ettanspotpicker系统进行挖点。这些蛋白质在阳性组胃癌细胞蛋白样品中表达上调的有5个，表达下调的有3个。
　　 3.对差异蛋白的质谱鉴定和数据库检索发现:在上述8个差异蛋白质点中有7个被鉴定为有意义的蛋白质分别为:开关相关蛋白70、远上游元件结合蛋白1、热休克蛋白60、膜联蛋白A7、小泛素样调节蛋白1、含伴侣蛋白的少尾复合体蛋白1和膜联蛋白A2;另外1个未能鉴定出有意义的蛋白质。对比胃癌细胞蛋白图谱发现:开关相关蛋白70、远上游元件结合蛋白1、热休克蛋白60、小泛素样调节蛋白1在阳性组胃癌细胞中表达上调，而膜联蛋白A7、含伴侣蛋白的少尾复合体蛋白1、膜联蛋白A2则在阳性组胃癌细胞中表达下调。
　　 4.应用Westernblot法验证差异蛋白的表达水平发现:远上游结合蛋白1在阳性组胃癌细胞中均表达上调，膜联蛋白A7和膜联蛋白A2在阳性组胃癌细胞中均表达下调，阳性组与空白对照组差异有统计学意义（P＜0.05），结果与蛋白质组学方法所得结果吻合。
　　 结论:
　　 1.ZNF139mRNA的表达在阳性组BGC823细胞中表达明显降低，说明siRNA抑制了ZNF139基因的转录。
　　 2.从siRNA抑制ZNF139前后的胃癌细胞总蛋白中分离出8个差异蛋白质点且其中7个被鉴定为有意义的蛋白，说明ZNF139基因的表达被抑制后胃癌细胞蛋白表达具有差异性。
　　 3.siRNA抑制ZNF139胃癌细胞的蛋白质中:开关相关蛋白70、远上游元件结合蛋白1、热休克蛋白60、小泛素样调节蛋白1表达上调，而膜联蛋白A7、含伴侣蛋白的少尾复合体蛋白1膜联蛋白A2表达下调，提示这些蛋白的表达与ZNF139基因的表达相关;上述蛋白与胃癌的增殖、凋亡、侵袭、转移等有关，进而说明ZNF139可能直接或间接与胃癌细胞的上述生物学行为有关。
　　 4.通过蛋白印迹法检验鉴定出的蛋白质在转染前后胃癌细胞中的表达，结果发现均与蛋白质组学鉴定结果相符合。这说明本研究鉴定出的蛋白质与ZNF139基因的生物学效应密切相关。
　　 5.对7种鉴定出的蛋白质的分析显示，它们在影响胃癌细胞增殖、侵袭转移及诱导细胞凋亡等方面发挥重要作用，进一步研究有可能找到关键的胃癌相关因子，但是它们与胃癌发生发展的具体机制尚需进一步研究。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 试验方法

3 统计学处理

结果

1 siRNA对胃癌细胞ZNF139 mRNA表达的影响

2 siRNA抑制ZNF139对胃癌细胞蛋白表达的影响

3 Western blot验证选定差异蛋白的变化

附图

附表

讨论

1 siRNA转染胃癌细胞后ZNF139 mRNA的表达

2 蛋白质组学方法研究siRNA抑制ZNF139对胃癌细胞蛋白表达的影响

结论

参考文献

综述 蛋白质组学方法在胃癌生物标志物研究中的应用与进展

致谢

个人简历