内质网应激相关蛋白ATF4及CHOP在横纹肌溶解致急性肾损伤中的作用及山莨菪碱的干预效应

摘要

目的:高强度或特殊军事训练,特别是在闷热潮湿的环境下,容易引起横纹肌溶解(rhabdomyolysis,RM)进而导致急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI);已成为严重影响部队战斗力的重要因素。目前对其发病机制尚未明了。研究AKI损伤机制并提高其救治水平对提高部队战斗力以及军事医学有着重大意义。吴广礼等人的前期研究表明肾小管上皮细胞的凋亡是导致AKI的重要机制。本研究通过给大鼠双后肢肌注甘油生理盐水,建立横纹肌溶解致急性肾损伤模型,应用免疫组化和westernblot等方法检测内质网应激关键性蛋白活化的转录因子4(activatingtranscriptionfactor4,ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancerbindingproteinhomologousprotein,CHOP)的表达及山莨菪碱对其的影响,进而探讨内质网应激介导的凋亡通路在AKI中的作用以及山良菪碱的干预效应,为急性肾损伤的防治提供新的理论依据。
　　 方法:(1)健康雄性SD大鼠42只,体重200-220g,采用完全随机分组方式分为三组:对照组(Control,CN,n=6)、急性肾损伤模型组(acutekidneyinjury,AKI,n=18)、山莨菪碱干预组(anisodamine,AD,n=18)。AKI组和AD组根据注射时间又分为三个亚组即1h组、6h组和24h组,每组6只大鼠。(2)采用给大鼠双后肢注射甘油生理盐水建立横纹肌溶解致急性肾损伤的模型。(3)使用全自动生化分析仪检测生化指标血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN),(4)应用ELISA法检测血肌红蛋白Mb;(5)应用光学显微镜观察肾组织形态学改变;(6)应用免疫组化和图像分析法检测肾组织中ATF4和CHOP的表达;(7)应用WesternBlot方法检测肾组织ATF4和CHOP的表达。(8)统计分析:实验数据均采用SPSS13.0软件包进行统计学处理,实验数据结果以均数±标准差((x)±s)表示。各组间均数比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),相关分析采用Pearson相关检验,以p＜0.05认为有统计学意义。
　　 结果:(1)与CN组比较,AKI组血浆BUN、Cr、Mb等指标均有明显升高(p＜0.05,p＜0.01),其中血浆BUN、Cr、Mb均于肌注甘油后24小时达到高峰(p＜0.01);AD1h、AD6h、AD24h组较同期AKI组均显著降低(p＜0.05,p＜0.01);(2)光镜观察HE染色发现CN组大鼠肾组织结构无明显变化;AKI1h、6h、24h组病理损伤逐渐加重,受损较重部位集中在皮髓交界、外髓外带的近端肾小管,AD各组较AKI同期各组明显减轻。(3)免疫组化图像分析显示:①与CN组相比,ATF4在甘油肌注1小时即发现表达(p＜0.01),随着甘油作用时间的延长其表达逐渐增加,在AKI6h组达到最高(p＜0.01),但在24h组明显下降(p＜0.01)。AD1h、AD6h、AD24h均较同期AKI各组表达减少(p＜0.05,p＜0.01)。②随着甘油作用时间的延长,肾组织中CHOP蛋白的表达呈递增趋势,AKI6h、24h均显著高于对照组与AKI1h组(p＜0.01);到AKI24h达到高峰;AKI1h与对照组比较则无明显差异(p＞0.05);除AD1h外,AD6h、AD24h均较同期AKI各组表达减少(p＜0.01);(4)WestemBlot结果显示:在内参GAPDH表达量基本一致的情况下,①对照组ATF4条带颜色较浅,AKI1h,AKI6h和AKI24h条带颜色逐渐加深,在AKI6h颜色达最深;而AD各组蛋白条带的颜色都要比同期AKI组浅,对其进行半定量分析,各组间均有统计学差异(p＜0.05,p＜0.01);②CHOP蛋白在对照组、AKI1h条带颜色均较浅,随着甘油作用时间的延长,颜色条带逐渐加深,在AKI24条带颜色达最深;而AD各组蛋白条带均比同期AKI各组颜色浅,对其进行半定量分析,各组均有统计学差异(p＜0.05,p＜0.01)(5)相关性分析结果:血清Mb水平与BUN、Cr呈显著正相关(r=0.872,p＜0.05;r=0.716,p＜0.05);血浆Mb水平与肾组织ATF4呈显著负相关(r=-0.882,p＜0.01);与肾组织CHOP呈显著正相关(r=0.993,p＜0.01)。
　　 结论:1.甘油肌注致横纹肌溶解可通过上调肾组织CHOP的表达,激活ERS,进而引起急性肾损伤。
　　 2.甘油肌注致横纹肌溶解早期可上调肾组织ATF4的表达发挥代偿性肾损伤保护作用,随着甘油作用时间的延长,其表达下调进而引起急性肾损伤。
　　 3.山莨菪碱可下调甘油致RM大鼠肾组织CHOP的表达,这可能是其肾脏保护的主要机制之一。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 主要实验仪器

3 实验方法

4 指标检测及方法

结果

1 一般情况的变化

2 肾功能及血清Mb指标的变化

3 肾组织形态的变化

4 免疫组织化学方法检测肾组织ATF4及CHOP表达情况

5 Western blot法检测大鼠肾组织中的ATF4及CHOP蛋白表达的变化

6 相关性分析结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历