神经生长因子和血清素在骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化过程中的作用

摘要

众所周知，骨折愈合需要较长时间。有统计资料[1]表明约有5％～10％骨折患者愈合能力差，发生骨折延迟愈合或不愈合，影响患肢功能，甚至出现严重的并发症。临床观察和研究表明骨折愈合具有加速潜力。骨折加速愈合以及异位骨化在骨折合并颅脑外伤患者中普遍存在[2]。颅脑损伤后释放到血液循环中未知的体液因素可增强成骨作用[3]。
　　 神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)和血清素(Serotonin)均属于重要的神经递质。脑外伤后，机体通过一定的途径，上调了NGF的水平和下调了血清素的水平，从而在加速骨折愈合的过程中起到重要作用[4]。研究证实在正常骨组织和骨折骨痂组织中均有NGF及其受体的表达。局部给予NGF后，发现其对骨折愈合具有明显的加速愈合的作用。研究中证实[5]:在成骨细胞，骨细胞，成纤维细胞中5-HT(2b)受体mRNA均有表达。新的研究发现血清素也可以抑制骨质的流失。骨髓间充质干细胞(BoneMarrowStemCell，BMSCs)在一定条件下可向成骨细胞方向转化[6]。Boes等[7]发现颅脑外伤病人血清中的成骨细胞因子可以促进未分化的间充质干细胞有丝分裂向成骨细胞转化，从而加速骨折的愈合。本实验旨在研究神经生长因子和血清素在骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化过成中所起的作用，进一步揭示骨折合并脑外伤后骨折加速愈合的机制，并为今后预防和治疗骨折延迟愈合、不愈合和预防老年性骨质疏松方面提供新的思路。
　　 目的:研究神经生长因子和血清素在骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化过成中所起的作用，进一步揭示骨折合并脑外伤后骨折加速愈合的机制，并为今后在预防和治疗骨折延迟愈合、不愈合和预防老年性骨质疏松方面提供新的思路。
　　 方法:本实验采用全骨髓贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)。将其培养至第3代骨髓间充质干细胞，诱导其向成骨细胞转化，在向成骨诱导转化的过程中加入血清素、神经生长因子这两种干扰因素，观察成骨细胞变化。
　　 1、样品制备
　　 取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，按1×105/L的浓度分别接种在8只培养瓶中，每组4只共分为1和2两个组，分别培养14天和21天。在1组中A1为对照组细胞仅用条件培养基（含体积分数10％的胎牛血清FBS，低糖DMEM培养基，0.1μmol/L地塞米松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油钠，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）诱导转化。B1为NGF组，C1为血清素组，D1为NGF和血清素组。2组中A2为对照组细胞仅用条件培养基（含体积分数10％FBS低糖DMEM培养基，0.1μmol/L地塞米松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油钠，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）诱导转化。B2为NGF组，C2为血清素组，D2为NGF和血清素组。
　　 2、检测方法
　　 2.1、Westernblotting检测Ⅰ型胶原蛋白(TypeⅠcollagen)
　　 2.2、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法定量分析骨钙素(Osteocalcin)分泌量
　　 2.3、免疫组化方法定性分析钙化结节
　　 2.4、酶标仪法检测碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)活性
　　 结果:诱导后14天酶标仪法检测成骨细胞碱性磷酸酶活性均增加D1＞B1＞C1＞A1(P＜0.01)。免疫组化方法定性分析钙化结节均呈现阳性。Westernblot-tin定量检测Ⅰ型胶原蛋白D1＞B1＞C1＞A1(P＜0.01)。21天时行ELISA定量分析骨钙素分泌量D2＞B2＞C2＞A2(P＜0.01)
　　 结论:在本实验中证实NGF和血清素均可以促进间充质干细胞向成骨细胞转化，在此过程中NGF比血清素有效，两者联合使用比单纯应用NGF效果更好。本实验中D1、D2组在碱性磷酸酶的活性、骨钙素分泌量、Ⅰ型胶原蛋白量上均高于其他组，神经生长因子、血清素两者之间在间充质干细胞向成骨细胞转化过程中存在协同作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

结果

2．1 BMSCs形态学观察

2．2 碱性磷酸酶检测结果

2．3 Ⅰ型胶原蛋白检测

2．4 骨钙素的检测

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历